Казахский Национальный университет им. аль-Фараби
УДК 601.4:618.19-006.55 На правах рукописи
АЙСИНА ДАНА ЕВГЕНЬЕВНА
Взаимодействие miRNA c mRNA генов, участвующих в развитии рака молочной железы
6D070100-Биотехнология
Диссертация на соискание степени доктора философии (PhD)
Научные консультанты:
доктор медицинских наук, профессор, член корр. РАН Имянитов Е.Н.;
доктор биологических наук, профессор Иващенко А.Т.
Республика Казахстан Алматы, 2019
СОДЕРЖАНИЕ
ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ 4
ВВЕДЕНИЕ 5
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1.1. Рак молочной железы 9
1.1.1 Роль генов в развитии рака молочной железы 11
1.1.2 Субтипы рака молочной железы 14
1.2 Маркеры и методы диагностики рака молочной железы 15 1.3 Роль транскрипционных факторов в развитии рака молочной железы 17 1.3.1 Роль транскрипционных факторов семейства E2F в развитии РМЖ 18
1.4 Биогенез miRNA 19
1.4.1 miRNA в развитии рака молочной железы 21
1.5 Гены, участвующие в развитии рака молочной железы субтипа HER2 22 1.6 Гены, участвующие в развитии рака молочной железы субтипов luminal A и B
23 1.7 Гены, участвующие в развитии рака молочной железы субтипа triple- negative
24
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 26
3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 28
3.1 Создание базы данных по miRNA человека 28
3.2 Создание баз данных по генам, связанным с раком молочной железы 31 3.3 Характеристики сайтов связывания miRNA с mRNA генов семейства E2F, связанных с развитием РМЖ
34 3.4 Характеристики сайтов связывания miR-1322 с mRNA генов, участвующих в развитии рака молочной железы
44 3.5 Характеристики сайтов связывания miRNA с mRNA кандидатных генов субтипа HER2
50 3.5.1 Характеристики сайтов связывания miRNA из miRBase с mRNA кандидатных генов субтипа HER2
50 3.5.2 Характеристики сайтов связывания miRNA (Londin et al.) c mRNA кандидатных генов субтипа HER2
53 3.6 Характеристики сайтов связывания miRNA с mRNA кандидатных
генов субтипов luminal A и B 58
3.6.1 Характеристики сайтов связывания miRNA из miRBase c mRNA кандидатных генов субтипов luminal A и B
58 3.6.2 Характеристики сайтов связывания miRNA (Londin et al.) с mRNA кандидатных генов субтипов luminal A и B
60 3.7 Характеристики сайтов связывания miRNA с mRNA кандидатных генов субтипа triple-negative
64 3.7.1 Характеристики сайтов связывания miRNA из miRBase с mRNA кандидатных генов субтипа triple-negative
64 3.7.2 Характеристики сайтов связывания miRNA (Londin et al.) с mRNA кандидатных генов субтипа triple-negative
69 3.8 Предсказание кластеров сайтов связывания miRNA с mRNA 73
3
кандидатных генов
3.9 Взаимодействия miRNA-5p и miRNA-3p с mRNA FOXF2, PLPPR3, KIAA2026, GLYCTK и CCDC42B генов
92
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 99
ВЫВОДЫ 100
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 102
ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ Ago2 - Argonaute 2 protein - белок комплекса RISC
CDS - белок-кодирующая область mRNA
E2F - семейство транскрипционных факторов E2F1 - E2F8
GenBank - база данных по нуклеотидным последовательностям белок- кодирующих генов и РНК
HER2 субтип - HER2 положительный субтип
luminal A и B субтипы - Люминальный A и Б субтипы
miRNA - mRNA-inhibiting RNA - миРНК (мРНК-ингибирующая РНК) miRBase – база данных по предшественникам и зрелым miRNA
mRNA - матричная РНК (мРНК)
NCBI - National Center for Biotechnology Information - национальный центр биотехнологической информации
pre-miRNA - предшественник miRNA pri-miRNA - предшественник pre-miRNA
PUBMED - Biochemical Literature Citation and Abstracts – база данных по абстрактам и цитированию биохимической литературы
RISC - RNA-induced silencing complex - РНК-индуцируемый комплекс выключения генов
triple-negative субтип - трижды-отрицательный или базальноподобный субтип
XPO5- exportin 5 База данных - БД
ОЗ - онкологическое заболевание
НРМЖ - наследственный рак молочной железы нт - нуклеотид
РМЖ - рак молочной железы
5'UTR - 5'-нетранслируемая область mRNA 3'UTR - 3'-нетранслируемая область mRNA
RPKM - reads per kilobase per million of mapped reads - число прочтений на тысячу нуклеотидов на миллион картированных прочтений
TNM - Tumor - первичная опухоль, Node - метастазы в региональные лимфатические узлы, Metastases - отдалённые метастазы.
5
ВВЕДЕНИЕ Общая характеристика работы.
Работа посвящена изучению взаимодействия miRNA c mRNA генов, участвующих в развитии рака молочной железы, и поиску диагностических маркеров на основе ассоциаций miRNA и генов для ранней диагностики этого заболевания.
Актуальность темы исследования.
Рак молочной железы (РМЖ) занимает одно из первых мест среди всех онкозаболеваний в мире. Данные статистики последних лет демонстрируют интенсивный, неуклонный рост заболеваемости и смертности от рака молочной железы в Казахстане и других странах [1-2].
В связи с тем, что более 50% больных раком молочной железы впервые обращаются в медицинские учреждения уже на поздних стадиях заболевания, в структуре смертности населения Казахстана онкологические заболевания продолжают занимать 2 место после сердечно-сосудистых заболеваний [3]. Поэтому актуальность разработки новых и совершенствование существующих методов диагностики не вызывает никаких сомнений.
Рак молочной железы является многофакторным заболеваниеми и его возникновение зависит от изменения экспрессии, мутаций множества генов.
Например, до 25% наследственных случаев заболеваемости РМЖ связаны с мутацией в одном из некоторых идентифицированных, высоко- пенентрантных генов (BRCA1, BRCA2, PTEN, TP53, CDH1 и STK11), которые приводят к 80% риска заболеваемости РМЖ. Дополнительные 2% - 3%
случаев обусловлены мутацией в умеренно-пенентрантных генах (например, CHEK2, BRIP1, ATM и PALB2), каждый из которых связан с двукратным увеличением риска заболеваемости раком молочной железы [4]. Различные субтипы рака молочной железы отличаются набором кандидатных генов, участвующих в развитии этого заболевания. Установление взаимодействия miRNA с mRNA генов, участвующих в развитии рака молочной железы, является одним из наиболее перспективных методов исследований. miRNA представляют собой небольшие молекулы РНК, влияющие на экспрессию и трансляцию мРНК (mRNA) и легко обнаруживаются в крови. Некоторые из них могут быть потенциальными биомаркерами рака молочной железы [5].
В настоящее время в мире не существует полной базы генов и miRNA, связанных с раком молочной железы. Поэтому необходимо выявление ассоциаций miRNA с генами, указывающих на рак молочной железы и его субтипы, которые могут быть биомаркерами для диагностики субтипов РМЖ и играть ключевую роль в его возникновении и развитии. Под ассоциацией понимается связь конкретной(ых) miRNA с конкретным(ыми) геном.
Результаты исследования взаимодействия miRNA с mRNA генов, участвующих в развитии рака молочной железы, могут послужить в качестве основы для дальнейших разработок молекулярно-генетических маркеров,
которые будут нужны для выявления групп повышенного риска развития рака молочной железы у населения Республики Казахстан.
Цель работы: изучить характеристики взаимодействия miRNA c mRNA генов, участвующих в развитии рака молочной железы.
Задачи исследования:
1. Создать базы данных по miRNA и генам, участвующим в развитии рака молочной железы.
2. Установить характеристики сайтов связывания miRNA в mRNA генов семейства E2F и участие miR-1322 в развитии рака молочной железы.
3. Определить характеристики взаимодействия miRNA с mRNA генов, участвующих в развитии субтипа HER2 рака молочной железы.
4. Определить характеристики взаимодействия miRNA с mRNA генов, участвующих в развитии субтипов luminal A и B рака молочной железы.
5. Определить характеристики взаимодействия miRNA с mRNA генов, участвующих в развитии субтипа triple-negative рака молочной железы.
6. Установить особенности взаимодействия пар miRNA-5р и miRNA-3р c mRNA их генов-мишеней.
7. Установить ассоциации miRNA и mRNA генов для разработки методов диагностики рака молочной железы.
Объекты исследования: нуклеотидные последовательности miRNA и mRNA генов человека, участвующих в развитии рака молочной железы.
Предмет исследования: характеристики взаимодействия miRNA с mRNA генов, участвующих в развитии РМЖ.
Научная новизна исследования.
Научная новизна и оригинальность исследования заключается в установлении характеристик взаимодействия miRNA с mRNA генов, связанных с развитием рака молочной железы. Сайты взаимодействия miRNA с mRNA были выявлены в 5’UTR, CDS и 3’UTR mRNA генов- мишеней.
Впервые выявлено, что из 602 кандидатных генов рака молочной железы, только mRNA E2F3 гена содержит множественные сайты для 22 miRNA в CDS. Было выявлено, что взаимосвязи сайтов связывания этих miRNA с mRNA сложились давно и на протяжении миллионов лет дивергенции изученных объектов эти взаимосвязи практически не изменились.
Впервые установлена кластерная организация сайтов связывания miRNA в mRNA кандидатных генов РМЖ.
Впервые определены характеристики сайтов связывания miRNA в mRNA кандидатных генов субтипов HER2, luminal A и B, triple-negative (basal-like) рака молочной железы.
Впервые выявлены ассоциации miRNA и mRNA генов, участвующих в развитии рака молочной железы, которые предложены в качестве диагностических маркеров.
Теоретическая значимость работы заключается в создании базы данных по miRNA и генам, участвующим в развитии рака молочной железы.
7
Установлены характеристики взаимодействия miRNA с mRNA кандидатных генов рака молочной железы. Выявлены характеристики взаимодействия miRNA с mRNA генов, участвующих в развитии субтипа HER2 рака молочной железы. Выявлены характеристики взаимодействия miRNA с mRNA генов, участвующих в развитии субтипов luminal A и B рака молочной железы. Выявлены характеристики взаимодействия miRNA с mRNA генов, участвующих в развитии субтипа triple-negative рака молочной железы. Установлена структурная организация сайтов связывания miRNA в mRNA генов рака молочной железы. Установлены ассоциации miRNA и mRNA генов, участвующих в развитии рака молочной железы. Эти результаты существенно расширяют представление о функционировании miRNA.
Практическая ценность исследования заключается в разработке основ метода ранней диагностики субтипов рака молочной железы с использованием ассоциаций miRNA и генов-мишеней. Полученные результаты используются при чтении дисциплины «Бионанотехнологии в диагностике и терапии».
Основные положения, выносимые на защиту:
Из 602 кандидатных генов рака молочной железы 325 кандидатных генов, включающих специфичные гены субтипов заболевания, являются мишенями miRNA и их экспрессия может регулироваться этими miRNA.
Сайты связывания miRNA находятся в 5’UTR, CDS и 3’UTR mRNA кандидатных генов рака молочной железы. Распределение сайтов связывания miRNA в 5’UTR, CDS или 3’UTR специфично для каждого из генов.
Большинство кандидатных генов являются мишенью одной или нескольких miRNA сайты связывания, которых расположены в mRNA отдельно друг от друга. В mRNA других кандидатных генов сайты связывания miRNA расположены с наложением нуклеотидных последовательностей, образуя кластеры сайтов связывания двух и более miRNA.
Для субтипов HER2, luminal A и B, triple-negative имеются специфические ассоциации miRNA и mRNA кандидатных генов разных субтипов.
Несколько пар miRNA-5р и miRNA-3р, происходящих из одной пре- miRNA, взаимодействуют c mRNA их генов-мишеней полностью комплементарно.
Связь с планом основных научных работ.
Диссертационная работа выполнена в рамках проекта «Разработки тест- систем ранней диагностики сердечно-сосудистых, онкологических и нейродегенеративных заболеваний на основе ассоциаций miRNA и их генов мишеней» № AP05132460 МОН РК.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены:
- на международных научных конференциях студентов и молодых учёных «Фараби алеми», КазНУ им. аль-Фараби, Алматы, 2017г. и 2018 г.;
- на международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биотехнологии, экологии и физико-химической биологии», Алматы, 6-7 апреля 2017 г.;
- на IX международном конгрессе «Biotechnology: state and development prospects», Москва, Россия, 20-22 февраля, 2017 г.;
- в II всероссийской конференции с международным участием «High- throughput sequencing in genomics», Новосибирск, Россия, 18-23 июня, 2017 г.;
- на международной научно-практической конференции «The science of new time: from idea to result», Санкт-Петербург, Россия, 18-19 августа 2017 г.;
- на международной конференции «Clinical proteomics. Postgenomic medicine» Москва, Россия, 30 октября-1 ноября 2017 г.;
- на международном форуме «Biotechnology: state and development prospects», Москва, Россия, 23-25 мая, 2018 г.;
- на 11 Международной конференции BGRS/SB-2018 «Integrative Bioinformatics and Systems Biology», WIBSB-2018, Новосибирск, Россия, 22- 23 августа 2018 г.;
- на Московской международной конференции «Molecular phylogenetics and biobanking biodiversity » (Molphy-5), Москва, Россия, 28 августа, 2018 г.;
- на международной конференции «Biological markers in fundamental and clinical medicine», Прага, Чехия, 31 октября-02 ноября, 2018 г.;
-на международном конгрессе “Biotechnology: state of the art and perspectives”, Москва, Россия, 25-27 февраля, 2019 г.;
- на международной конференции «9-ая Московская конференция по вычислительной молекулярной биологии МССМВ'19», Москва, Россия, 27-30 июля 2019 г.
Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 25 печатных работах, в том числе 1 статье в международном журнале с импакт- фактором, цитируемом в Web of Science; девять статей в республиканских научных журналах из перечня Комитета по контролю в сфере образования и науки; 15 тезисов в материалах международных конференций.
Структура диссертации. Диссертация изложена на 125 страницах и состоит из следующих разделов: обозначения и сокращения, введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение и выводы, список использованных источников из 290 наименований; содержит 60 таблиц и два рисунка.
9
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Рак молочной железы
Рак молочной железы (РМЖ) является распространенным онкологическим заболеванием во всем мире, в том числе в Центральной Азии [6-7]. В Казахстане обнаруживается рост показателя заболеваемости, пики заболеваемости и смертности отмечались у лиц в возрасте 60-74 лет и 75-84 [8-10]. Высокие показатели смертности особенно заметны у женщин с диагнозом поздней стадии РМЖ [11]. Выявлено, что у 20% - 50% пациентов с впервые диагностированным РМЖ, заболевание было уже на поздней стадии [11, c. 4797-4802]. Поздняя диагностика РМЖ негативно влияет на выживаемость больных раком. Таким образом, в развивающихся странах позднее обращение, слабая оснащенность оборудованием, неадекватные программы скрининга РМЖ приводят к выявлению рака на поздней стадии [12-13]. Связанные с пациентом факторы, такие как практика самоконтроля, кореллируют с меньшим количеством задержек начало лечения, в то время как восприятие низкого риска заболевания РМЖ приводит позднему лечению [13, c. 761-767]. Другие психологические и поведенческие факторы развития поздних стадий заболевания связаны как с задержками, связанными с больными, так и с системой здравоохранения, связанными с лечением РМЖ в странах южной Африки [12, c.2173-2182].
Существует много различных способов классификации рака молочной железы. Одним из них является, разработанная в 1943-1952 гг., система TNM для классификации злокачественных новообразований [14]. С момента своего появления система TNM стала международным средством описания анатомической степени рака и определения стадии рака, также может служить для того, чтобы помочь клиницисту в планировании лечения, может помочь с прогнозированием и оценкой результатов лечения. Для описания анатомической оценки болезни система TNM основана на оценке трех компонентов:
T - распространение первичной опухоли
N - степень поражения и наличие или отсутствие метастазов в регионарных лимфатических узлах
M - отсутствие или наличие отдаленных метастазов [15].
Добавление чисел к этим трем компонентам указывает на степень злокачественного заболевания: T0, T1, T2, T3, T4, N0, N1, N2, N3, M0, M1 [16]. Практика деления рака на группы в соответствии с так называемыми стадиями возникла из-за того, что показатели выживаемости были выше для случаев, когда заболевание было локализовано, чем для тех, в которых болезнь распространилась за пределы органа происхождения. Эти группы часто упоминались как раннее заболевание и позднее заболевание, что подразумевало некоторую регулярную прогрессию со временем. На самом деле, стадия заболевания на момент постановки диагноза может быть отражением не только скорости роста и расширения новообразования, но также типа опухоли и отношения опухоли и хозяина.
В гистологическом плане среди злокачественных опухолей молочной железы выделяются следующие типы (рисунок 1) [17]:
- Протоковый рак in situ - Дольковый рак in situ
- Инвазивный протоковый рак - Инвазивный дольковый рак
- Рак молочной железы с признаками воспаления - Медуллярный рак
- Коллоидный рак - Папиллярный рак - Метапластический рак
Рисунок 1 - Гистологическая классификация РМЖ [17, c. 955-960].
Чаще всего (65-80%) встречается инвазивный протоковый рак, который демонстрирует наибольшую морфологическую гетерогенность. Известны, как минимум, 5 типов морфологических структур, демонстрирующие пространственное многообразие опухолевых клеток. К ним относятся альвеолярные, тубулярные, трабекулярные, солидные структуры и дискретные группы опухолевых клеток [18].
Рак молочной железы является мультифакторным заболеванием. Среди множества факторов, которые могут влиять на экспрессию генов, наиболее вероятными причинами являются мутации с высокой степенью пенентрантности, унаследованные или приобретенные. Однако, процент случаев заболеваемости раком молочной железы, этиологически связанных с
11
этим типом мутаций, не превышает 10% [19-20]. Высокая вероятность развития рака от этих мутаций объясняется тем, что пораженные гены кодируют белки, участвующие в клеточных процессах, таких как: ДНК репарация, регуляция клеточного цикла и защита от свободных радикалов, являющихся важными функциями для поддержания стабильности и целостности генома [20, c. 703-718]. Существуют системы репарации, ответственные за исправление повреждений или ошибок [21]. Однако в раковых клетках стресс, вызванный внешними факторами, может увеличить частоту мутаций, поэтому системы репарации не справляются с их высоким уровнем [22]. Химические факторы, ионизирующие излучения и даже плохо сбалансированное питание в настоящее время считаются факторами риска, которые могут способствовать развитию рака [23].Было замечено, что плохо сбалансированное питание, а именно чрезмерное потребление жирных продуктов увеличивает как гиперплазию, так и гипертрофию жировой ткани.
Эта ткань является основным производителем эстрогенов у женщин в постменопаузе, так что их неконтролируемый рост приводит к большему увеличению выработки эстрогенов, чем обычно. Влияние этих гормонов на процессы клеточной пролиферации увеличивает вероятность того, что эти клетки, несущие мутации с высокой пенетрантностью, разрастаются в молочной железе [24].
Большую роль в возникновении рака молочной железы играет фактор наследственности. Наследственный рак молочной железы (НРМЖ) имеет аутосомно-доминантный тип наследования, может возникать в раннем возрасте, может передаваться как от материнской линии, так и отцовской, отличается выраженной генотипической и фенотипической гетерогенностью.
НРМЖ в 70% случаев ассоциирован с мутациями в генах BRCA1, BRCA2 [25]. В то время как менее 15% женщин с раком молочной железы имеют членов семьи с этим заболеванием, женщины, у которых есть близкие родственники с раком молочной железы, имеют высокий риск заболеваемости [26-38]. Например, наличие близкого родственника (мать, сестра или дочь) с раком молочной железы почти удваивает риск женщины, в то время как наличие двух близких родственников с этим заболеванием увеличивает риск женщины примерно в 3 раза. Интересно, что женщины с отцом или братом, у которых в семейном анамнезе есть рак молочной железы, также имеют более высокий риск этого заболевания. В контексте одного индивидуума женщина с раком в одной молочной железе имеет более высокий риск развития нового рака в другой молочной железе или в другой части той же молочной железы [39].
1.1.1 Роль генов в развитии рака молочной железы
Знание о генах вовлеченные в развитие рака важны для разработки более эффективных подходов к снижению заболеваемости и смертности от заболевания. Роль генов заключается в регуляции полноценного роста клеток молочной железы, с целью предупредить возможное появление онкологического заболевания. Если имеется аномалия или мутация в этих
генах, риск появления рака груди значительно увеличивается. Аномалии BRCA1 и BRCA2 генов, провоцируют десять процентов всех онкологических заболеваний молочной железы. Причины всех разновидностей онкологий молочной железы – именно изменения, присутствующие на генном уровне.
За последнее десятилетие комплексные усилия по секвенированию выявили геномные формы рака человека. Для большинства типов рака этот геном состоит из небольшого количества генов, мутирующих с большим процентом появления опухолей и гораздо большего числа стабильных генов. На сегодняшний день в этих исследованиях было обнаружено примерно 140 генов, которые при изменении внутригенных мутаций могут способствовать или «стимулировать» онкогенез [40]. Гены BRCA1 и BRCA2 кодируют аминокислотные последовательности ядерных белков, которые участвуют в регуляции восстановления ДНК и деления клеток. В интактном (не мутантном) состоянии оба гена выступают в качестве супрессоров опухоли и обеспечивают целостность генома. Кроме того, белковые продукты генов репрессируют транскрипционную функцию гена рецептора эстрогенов, сдерживая, таким образом, избыточную пролиферацию клеток молочной железы и других эстрогензависимых органов, в частности при половом созревании и беременности. Мутации в генах BRCA1 и BRCA2 приводят к повышению уровня хромосомной нестабильности в клетках, что может способствовать их опухолевой трансформации. На сегодняшний день известно более 1000 различных мутаций генов BRCA1 и BRCA2, связанных с повышением риска развития рака молочной железы, яичников, предстательной железы, кишечника, гортани, кожи и др. Для реализации онкогенного эффекта достаточно, чтобы мутация присутствовала хотя бы в одном аллеле. При обнаружении мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 у женщины риск развития рака молочной железы и/или яичников составляет высокий процент. Идентификация мутаций BRCA1/2 позволяет проводить профилактические меры, которые включают скрининг на магнитно- резонансную томографию или операции по снижению риска, что улучшает выживаемость [41-42].
В последнее время различные гены, такие как ген АТМ (ген атаксии- телеангиэктазии), CHEK2 (checkpoint kinase 2), TP53 (опухолевый белок p53), CDH1 (cadherin 1), PTEN (phosphatase and tensin homolog), RAD51C (RAD51 паралог C), PALB2 (partner and localizer of BRCA2) и BRIP1 (BRCA1 interacting protein C-terminal helicase 1) привлекают внимание как восприимчивые гены рака молочной железы.
Ген атаксии-телеангиэктазии (ATM) ответственен за повышенную чувствительность к ионизирующей радиации и, следовательно, за повышенный риск индуцированных ею злокачественных новообразований.
Действие гена проявляется даже в гетерозиготном состоянии, а доля гетерозигот среди населения в целом составляет 1-2%. При наличии данного гена даже такая процедура, как регулярная маммография, по-видимому, увеличивают риск рака молочной железы. Ген ATM дефектен при редком аутосомно-рециссивном заболевании атаксии телеангиэктазии (AT), которое
13
сопровождается гиперчувствительностью к ионизирующему излучению, иммунной недостаточностью, риском злокачественных заболеваний, мозжечковой атаксией вследствие дегенерации нейронов и других факторов [43].
Ген CHEK2 кодирует синтез белка-фермента чекпойнт-киназы 2. Белок данного гена CHEK2 контролирует процессы репарации ДНК и клеточного деления, тем самым участвуя в поддержании стабильности генома. Фермент активируется в ответ на повреждение молекулы ДНК, блокируя клеточный цикл в фазе G1 или запуская процесс апоптоза, выступая в качестве супрессора злокачественной трансформации клеток. Мутации гена CHEK2 приводят к синтезу неполноценного укороченного белка и ассоциированы с возникновением наследственных форм рака молочной железы [44].
Белок p53 (кодируемый геном TP53) является ключевым участником в ответах на стресс, которые сохраняют геномную стабильность, реагируя на множество факторов, таких как повреждение ДНК, гипоксию, метаболический стресс и активацию онкогена [45]. Кроме того, р53 взаимодействует с многочисленными клеточными белками, включая те, которые контролируют запрограммированную гибель клеток. Этот ген супрессора опухолей часто встречается в мутантном виде в различных твердых опухолях, включая опухоль молочной железы. Эти мутации приводят к отсутствию или дисфункции соответствующего белка.
Проведение генетического тестирования других генов повышенной восприимчивости к раку молочной железы, таких как TP53, PTEN и CDH1, также является важной профилактической мерой. В настоящее время, секвенирование нового поколения позволило одновременное тестирование мутаций в генах с высокой пенетрантностью и в генах с более умеренным риском. Мультигенные панели теперь коммерчески доступны и все чаще используются при оценке риска рака. У генов с высокой пенетрантностью наследственные мутации приводят к риску развития рака молочной железы в пять раз выше, чем мутации в генах с умеренной пенетрантностью, которые связаны с двукратным увеличением риска. Риски развития рака, связанные с мутациями в генах с меньшей предрасположенностью, все еще изучаются.
Например, мутации в PALB2, которые первоначально считались причиной умеренного риска рака молочной железы, теперь, похоже, связаны с пятикратным или большим увеличением возникновения РМЖ [46]. Кроме того, мутации в генах репарации ДНК, такие как BRIP1, RAD51C и PALB2, связаны с повышенным риском развития рака молочной железы.
Было показано, что FOXF2, PLPPR3, KIAA2026, GLYCTK и CCDC42B играют важную роль в развитии рака молочной железы [47, 48]. Уровень экспрессии генов FOXF2, PLPPR3, KIAA2026, GLYCTK и CCDC42B в молочной железе варьирует от 0,1 до 5,5 RPKM. Forkhead box F2 (FOXF2) функционирует как фактор транскрипции и играет решающую роль в программировании органогенеза, регуляции эпителиально-мезенхимального перехода (EMT) и пролиферации клеток. Данные недавних исследований продемонстрировали участие FOXF2 в раке молочной железы [49]. Известно,
что снижение экспрессии mRNA FOXF2 связано с ранним началом метастазирования и плохим прогнозом при раке молочной железы [50].
1.1.2 Субтипы рака молочной железы
Благодаря развитию молекулярно генетических технологий установления причин онкологических заболеваний (ОЗ) в последние годы выявлены десятки и сотни генов участвующих в развитии конкретных типов и субтипов ОЗ [51]. На основе иммуногистохимического исследования экспрессии клетками карциномы молочной железы рецепторов к эстрогену и прогестерону (ER и PR), а также рецептора эпидермального фактора роста 2- го типа (Hеr2/neu, ErbB2) в настоящее время в молекулярной классификации РМЖ выделяется четыре основных молекулярных субтипа [52-55]. Они различаются благодаря тому, какие цитокератины в них экспрессируются (люминальные или базальные), а также присутствует или отсутствует амплификация гена HЕR2, так же основываются на профилях экспрессии генов в соответствии со следующими маркерами: рецептор эстрогена (ER), рецептор прогестерона (PR), рецептор андрогенов (AR), белки антиапоптоза (Bcl-2, p53), белки пролиферации клеток, матриксные металлопротеиназы (ММР), интегрины, белки передачи трансдукции, циклины, циклин зависимые киназы (CDK), эпителиально- мезенхимальные факторы, кадгерины, транскрипционные факторы, факторы контроля метастаз, факторы, определяющие кровеносные сосуды [56-59].Эти субтипы представляют собой разные болезни с разной этиологией, молекулярным патогенезом и прогнозом, различаясь между собой характерными наборами маркеров.
На основе иммуногистохимических маркеров рецептора эстрогена (ER), рецептора прогестерона (PR) и рецептора эпидермального фактора роста человека 2 (HER-2), рак молочной железы подразделяется на четыре основных субтипа, включая luminal A (ER+ и / или PR+ , HER-2-), luminal B (ER+ и / или PR+, HER-2+), HER2 (ER-, PR-, HER-2+) и triple-negative (basal- like) (ER-, PR-, HER-2-) [60-61]. К люминальным относятся опухоли, экспрессирующие рецепторы к ER и PR, и в зависимости от экспрессии Hеr2/neu их классифицируют на А (не экспрессируют Hеr2/neu) и B (экспрессируют Hеr2/neu). HER2+ называются опухоли с гиперэкспрессией Hеr2/neu и отсутствием ER и РR. Опухоли, негативные по трем выше названным признакам, относятся к triple-negative (базальноподобному) РМЖ.
Кроме того, разные субтипы рака молочной железы имеют разные факторы риска и клиническое проявление. Например, для субтипа triple-negative рака молочной железы характерна повышенной агрессивность, более плохой прогноз по сравнению с другими субтипами [61, c.806-814].
Установлено, что люминальные типы связаны с менее агрессивным течением и хорошим прогнозом по сравнению с HER2 и triple-negative [55, c.
10393-10398; 62]. Triple-negative субтип связан с высокой частотой мутации BRCA1, агрессивным течением, отсутствием реакции на гормонотерапию и препараты для лечения РМЖ, низкой общей и безрецидивной
15
выживаемостью[55 c. 10393-10398; 62, c. 2492-2502; 63-64].
На основе клинических данных эти субтипы отличаются по частоте встречаемости, скорости роста, инвазивности, способности к метастазам и т.д. Причиной таких отличий субтипов РМЖ являются разные наборы генов, участвующих в проявлении этих субтипов онкогенеза [65].
1.2 Маркеры и методы диагностики рака молочной железы
В последние десятилетия произошел рост разработок методов диагностики рака молочной железы. Достижения в области генетического тестирования позволили сделать многие методы, например, секвенирование более быстрым и менее дорогостоящим, чем это можно было себе представить всего несколько лет назад. Так, с помощью секвенаторов нового поколения можно проводить одновременный анализ большого количества генов, участвующих в развитии рака молочной железы [66]. Для оценки риска рака эта новая технология проявилась в виде тест панелей со множеством генов, которые позволяют анализировать от шести до более 100 генов. Хотя подходы на основе анализа целого генома применяются для диагностики онкологических заболеваний, на сегодняшний день они менее эффективны, чем генные панели меньшего размера, ориентированные на диагностику рака [67].
Первоначально были созданы относительно ограниченные тесты для диагностики рака молочной железы, состоящие из шести генов, участвующих в РМЖ BRCA1/2, CDH1, PTEN, STK11, TP53. Впоследствии панели увеличились, до более чем 100 генов, которые обладают потенциальными ассоциациями с раком молочной железы, например, ATM, AXIN2, BARD1, CDKN2A, CHEK2, CYLD, MEN1, MLH1, MSH2, MSH6, MUTYH, PALB2, SLX4 и другие гены) [68].
В качестве диагностики рака молочной железы для женщин с повышенным риском данного заболевания используется метод МРТ анализа как дополнение к скрининговой маммографии. Исследования показали, что МРТ-скрининг улучшает диагностику рака, в дополнение к маммографии, обнаруживая большую долю раковых образований на этапах 0-I среди женщин с высоким риском [69-76].
Семейный анамнез рака молочной железы является решающим фактором в персонализировании методов ее диагностики. В настоящее время предпринимаются усилия по разработке генетического таргетного скрининга молочной железы. Для женщин с семейным анамнезом рака молочной железы, но без обнаружения мутаций с помощью генетического тестирования, семейный анамнез является ключевым фактором для использования таких методов диагностики, как МРТ и маммография груди [77].
Известны клинико-патологические маркеры диагностики РМЖ. К ним можно отнести лимфатические и сосудистые инвазии, степень дифференциации опухолевых клеток, размеры первичной опухоли (категория
Т), и наличие метастазов в регионарных подмышечных лимфатических узлах (категория N), наличие микрометастазов в костном мозге [78].
Одним из чувствительных прогностических клинико-морфологических маркеров является обнаружение опухолевых клеток в костном мозге на начальном этапе диагностики заболевания. У 30% больных операбельным ранним клиническим раком молочной железы можно обнаружить опухолевые клетки в костном мозге. Маркером более высокого риска рецидива и смерти и независимым прогностическим фактором худшей выживаемости являются скрытые раковые клетки в аспирате костного мозга.
В нынешнее время клинико-морфологические маркеры и факторы риска развития РМЖ пытаются заменить анализом генной сигнатуры, которую изучают с помощью разнообразных панелей микрочипов [79].
Молекулярные маркеры используюся для улучшения эффективности терапии и оценки прогноза заболевания. По данным Национального института здравоохранения США (NIH) и Консорциума биомаркеров, молекулярным маркером является индикатор патогенных или нормальных биологических процессов или фармакологический ответ на терапевтическое вмешательство [80]. Хотя большинство из этих маркеров являются белками, в последнее время модели экспрессии генов, измененная ДНК и miRNA также занимают важное место в качестве опухолевых маркеров [81-83].
До настоящего времени были обнаружены различные биомаркеры генов для диагностики рака молочной железы. Например, Erβ может уменьшить онкогенез путем снижения регуляции цикла опухолевых клеток и транскрипции в T-47D [84]. Кроме того, хемокиновый рецептор CXCR7 может способствовать пролиферации клеток рака молочной железы, взаимодействуя с EGFR [85].
Другим примером молекулярных маркеров является ген GATA3 – транскрипционный фактор, играющий важную роль в пролиферативной активности клеток рака молочной железы luminal А и B субтипов и дифференцировке, по сути, являясь опухолевым супрессором. По некоторым данным, позитивная экспрессия GATA3 может наблюдаться при инвазивной карциноме неспецифического типа, включая базальные опухоли, а также метапластический РМЖ [86, 87]. Кроме того, известно, что ген GATA3 может быть использован как диагностический маркер, показывающий высокую специфичность при метастазах рака молочной железы [88].
Также известно, что высокая экспрессия GATA3 ассоциирована с ER- положительными опухолями низкой степени злокачественности и сочетается с благоприятным прогнозом [89, 90]. Mehra с сотрудниками выявили, что низкий уровень экспрессии GATA3 наблюдался при опухолях с высокой степенью злокачественности, с наличием метастазов в лимфатических узлах, больших размеров, а также с отрицательным гормональным статусом. У таких пациенток наблюдалась низкая безрецидивная выживаемость по сравнению с больными, у которых опухоль имела высокий уровень экспрессии GATA3[91].
17
1.3 Роль транскрипционных факторов в развитии рака молочной железы
В человеческих клетках существует более 1000 различных ДНК- связывающих факторов транскрипции, которые могут модулировать экспрессию генов, воздействуя на активность РНК-полимеразы II [92].
Большинство факторов транскрипции имеют две различные структурные области, которые необходимы для их регуляторной функции: специфичный для последовательности ДНК-связывающий домен (например, цинковый палец) и домен активации транскрипции/репрессии, который взаимодействует с различными кофакторами (коактиваторами, корепрессорами). Известно, что факторы транскрипции являются одними из важнейших факторов онкологических заболеваний человека [93]. В большинстве случаев развитие рака молочной железы характеризуется изменением в регуляции факторов транскрипции [94, 95]. При развитии раковых заболеваний в генах, кодирующих транскрипционные факторы, часто происходят делеции, перестройки посредством хромосомных транслокаций или точечные мутации, которые приводят к увеличению, либо к потере его функций [96]. Также известно, что мутация кофакторов транскрипционных факторов является дополнительным механизмом канцерогенеза [97]. Кроме того, многие онкогенные сигнальные пути приводят к изменению функции транскрипционных факторов как средства реализации изменений экспрессии генов, которые в конечном итоге приводят к возникновению раковых клеток [96, c. 740-749].
Было подсчитано, что факторы транскрипции составляют 20% всех онкогенов при развитии онкологии [92, c. 252-263]. Классическим примером является онкосупрессор р53, изменение функций, которого происходит в более чем в половине всех случаев рака человека [98]. Белок TP53 лучше всего характеризуется, как ДНК связывающий транскрипционный фактор, способный связываться с несколькими сотнями различных промоторных элементов в геноме, следовательно, регулируя экспрессию сотен генов. Была выявлена фундаментальная роль TP53 в регулировании ключевых клеточных процессов, связанных с контролем над пролиферацией и сохранением целостности и стабильности генома [99]. Белок ТР53 активируется в ответ на различные сигналы стресса, такие как повреждение ДНК, гиперпролиферативные сигналы, гипоксия, окислительный стресс, подавляя клеточную трансформацию и пролиферацию, главным образом, путем остановки клеточного цикла, восстановления ДНК и апоптоза. За эти годы была выявлена роль TP53 в других клеточных процессах, таких как обмен веществ, ангиогенез, иммунные реакции, поддержание стволовых клеток [100]. Ключевая роль белка TP53 в патогенезе рака человека и высокая распространенность мутаций TP53 во всех раковых опухолях человека неоспорима. При раке молочной железы в настоящее время имеются убедительные доказательства того, что мутационный статус TP53 связан с худшим прогнозом и безрецидивной выживаемостью [101]. В этом
исследовании мутации в TP53 были связаны с повышенной смертностью у пациентов с luminal B, HER2, но не у пациентов с triple-negative опухолями.
Другим важным примером воздействия транскрипционных факторов на опухолегенез является семейство транскрипционных факторов E26 (ETS), которые влияют на статус рецепторов фактора роста (GFR), таких как рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) и рецептор эпидермального фактора роста человека 2 (HER2), и способствуя метастазированию [102]; c- Myb, фактор транскрипции, который часто требуется для трансформации миелоидных клеток-предшественников в клетках лейкемии [103]; семейство транскрипционных факторов активаторного белка 1 (AP-1), которые участвуют в различных злокачественных новообразованиях человека и активно участвуют в прогрессировании и развитии опухолей [104]; активатор транскрипции c-Myc, необходимый белок во многих клеточных процессах, начиная от пролиферации и до апоптоза. Изменение экспрессии c-Myc происходит во многих раковых опухолях человека, в то время как прекращение функции c-Myc приводит к регрессии опухоли [105].
1.3.1 Роль транскрипционных факторов семейства E2F в развитии РМЖ Семейство E2F представляют собой группу транскрипционных факторов, включая ≥ 10 участников, кодируемых восемью различными генами [106]. Исследователи разделили E2F на две подгруппы:
транскрипционные активаторы (E2F1-E2F3) и репрессоры (E2F4-E2F8) на основе их структур и функций [106, c.2403-2414; 107]. Семейство E2F характеризуется как центральный регулятор клеточного цикла [108]. Во время фазы G0 и ранней фазы G1 нефосфорилированный pRB связывается с некоторыми представителями семейства E2F и отрицательно регулирует их транскрипционную активность [109]. После этого циклин-зависимые киназные комплексы, опосредующие фосфорилирование белка ретинобластомы в поздней фазе G1, позволяют E2Fs активировать гены- мишени, что приводит к синтезу ДНК и белка, которые необходимы для входа в S-фазу [109, c. 157-169]. Более того, все большее число исследований выявило не только простое участие семейства E2F в регуляции клеточного цикла [110, 111], было также установлено, что многие физиологические процессы, такие как пролиферация, апоптоз, ДНК репарация, старение и аутофагия, которые, как известно, имеют решающее значение в онкогенезе, в значительной степени зависят от участия семейства E2F [110, c. 2389-2397;
111, c. 7882-7893].
При злокачественных новообразованиях человека семейство E2F часто разрегулированы. Известно, что повышение экспрессии E2F1 чаще происходит при развитии рака легкого по сравнению с нормальными тканями, а высокий уровень E2F1 дает менее положительный результат лечения [112, 113]. При карциноме клеток печени замечена сверхэкспрессия E2F1, E2F3, E2F4 и E2F8 в образцах опухолей [114-116]. Сверхэкспрессия E2F8 способствует пролиферации клеток карциномы печени путем продвижения клеток во вступление в S-фазу, которая может быть
