штамма МВ-1 Рисунок 8 – Активность нитратредуктазы штамма Марк-6
По мере увеличения концентрации глицерина активность НР возрастает с 0,0677 до 0,1623. При концентрации 30% глицерина активность нитратредуктазы почти достигает контрольного значения.
У штамма Марк-6 так же, как у МВ-1 высокая активность НР наблюдалась в варианте Д5 с резким падением активности в варианте Д8 (рисунок 8). Но при обработке глицерином, а именно в вариантах Г5 и Г30 активность этого фермента значительно выше, чем у штамма МВ-1 в этом варианте. При сравнении активностей в ряду криопротекторов внутри штамма Марк6 значение активности НР в этом варианте немного ниже, чем в контроле. Наблюдающееся снижение активности НР при концентрации глицерина 15% объяснить трудно. Возможно, особая чувствительность именно к этой концентрации глицерина, обусловленная видовой спецификой, вызывает торможение активности нитратредуктазы.
Таким образом, исследование физиолого-биохимических процессов культур микроводорослей, подвергшихся криозамораживанию, позволило выявить основные изменения, происходящие под влиянием инкубации в различных концентрациях криопротекторов ДМСО и глицерина. Выявлено, что для зеленой протококковой водоросли хлорелла штамма МВ-1 при замораживании наиболее щадящие условия создаются при инкубации в течение 5 минут с использованием 30%-ного глицерина в сочетании с 0,4 М сахарозой. Для синезеленой нитчатой микроводоросли анабенопсис штамма Марк-6 достаточно хорошие условия
криозамораживания возникают при использовании сочетания 5% ДМСО с 0,4М сахарозой. В указанных вариантах уровень жизнеспособности, коэффициент размножения, содержание пигментов и активность нитратредуктазы сохраняются на уровне, близком к контролю.
Литература
1 Becker E.W. Limitations of heavy removal from waste water by means of algae// Water Res., 1983. 17:458- 466.
2 Becker E.W. Microalgae: biotechnology and microbiology// Cambridge studies in biotechnology, 1994.Vol.10.
3 Benson E.E., Johnston,J., Muthusami J., Harding K. Physical and engineering perspectives of in vitro plant cryopreservation// In: Plant tissue culture engineering. 2005. Ed. S. Gupta,Y. Ibaraki, Springer, Netherlands. pp:441- 473.
4 Кушнаренко С.В., Калбаева А., Айдаралимова А. Криоконсервация культур микроводорослей методом витрификации// «Актуальные проблемы альгологии, микологии и гидроботаники» - Мат-лы межд.научной конференции 11-12 сент.2009.- Ташкент, 2009.- С.189-190.
5 Джокебаева С.А., Калбаева А.М., Кушнаренко С.В. Изучение влияния различных криопротекторов и осмотиков на криоустойчивость некоторых культур микроводорослей // Межд.конференция «Биотехнология, нанотехнология, физико-химическая биология», посв. 100-летию со дня акад. Т.Б. Дарканбаева, Алматы, Вестник КазНУ, сер.биол., №3 (45), 2010, С.110-112.
6 Методы физиолого-биохимического исследования водорослей в гидробиологической практике. Киев:
Наукова Думка, 1975 г. – 247 с.
7 Клоченко П.Д., Медведь В.А., Борисова Е.В.,Царенко П.М. Особенности накопления нитритного азота в культурах хлорококковых водорослей//Альгология. – 2000. –Т.10, №3. – С.257-264.
8 В.А. Медведь. Активность нитратредуктазы микроводорослей в условиях культуры. – Гидробиологический журнал, 2008. – том 44, № 5, С. 94-109.
Тұжырым
Chlorella sp.(штамм МВ-1) жəне Anabaenopsis sp. (штамм Марк 6) микробалдырлар дақылдарының физиологиялық жəне биохимиялық қасиеттерін бақылауға жақын деңгейде сақтап қалуын қамтамасыз ететін витрификация əдісі арқылы криосақтаудың тиімді режимдері табылды.
Summary
Sparing modes of a cryopreservation of microalgae Chlorella sp. (strain МВ-1) and Anabaenopsis sp. (strain Mark 6) are picked up by the method of vitrification providing safety of physiological and biochemical properties at level, close to control.
59
ГЕНЕТИКА И МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 575.224; 575.1./.2.2.599.9; 577.21; 575.17
Абетов Д.А., Перфильева А.В., Турсунова A.T., Булентаева З.А., Бекманов Б.О., Джансугурова Л.Б.
АССОЦИАЦИЯ ПОЛИМОРФИЗМА G(5557)A ATM ГЕНА С ФАКТОРОМ РАДИАЦИОННОГО ОБЛУЧЕНИЯ В КАЗАХСТАНСКИХ ПОПУЛЯЦИЯХ
(Институт общей генетики и цитологии)
В статье представлены результаты исследования, направленного на выявление ассоциации полиморфного варианта G(5557)A гена ATM с фактором радиационного облучения в казахстанских популяциях, представляющих семьи из района действия Семипалатинского ядерного полигиона, и ликвидаторов последствий аварии на Чернобыльской АЭС, жителей г. Семипалатинска. В качестве контроля исследованы соответствующие когорты из экологически благоприятных регионов Алматинской области.
Выявлена ассоциация между фактором радиации и гетерозиготным носительством по полиморфизму АТМ G(5557)A. Установлено, что показатели относительного риска в популяции ликвидаторов аварии на ЧАЭС выше, чем в популяции семей Семипалатинского региона. Это объясняется большей дозой облучения, полученной данной когортой и выражается неблагоприятным медицинским статусом, в том числе развитием раковых заболеваний, сердечно-сосудистых и аутоиммунных патологий.
Одним из определяющих факторов радиочувствительности клетки является стадия жизненного цикла, на которой клетка подверглась облучению. За регуляцию клеточного цикла ответственен целый комплекс генов.
Недостаточное количество или отсутствие ферментов, регулирующих определённые стадии клеточного цикла, приводит к увеличению частоты мутирования и геномной нестабильности. Контроль за уровнем геномной нестабильности является одним из ключевых моментов в системе регуляции контроля клеточного цикла. В ходе клеточного цикла имеется несколько точек проверки уровня поврежденности генома, главными из которых являются «чекпоинты» на стадиях перехода G1/S и G2/M. Важную роль в контроле уровня геномной нестабильности и поврежденности генома играет ген ATM [1].
Ген АТМ “ataxia telangiectasia mutated” расположенный в положении 11q22-q23 [2] является одним из ключевых генов - регуляторов клеточного роста и деления. Кодируемый белок является ядерным серин- треониновой фосфобелком, имеющим молекулярную массу 350 kDA. Белок, кодируемый геном ATM принадлежит фосфоинозитол 3 киназному семейству (PI3), что предопределяет его роль в сигнальной трансдукции [3]. АТМ кодирует серин-треониновую протеинкиназу, которая активируется при наличии в клетках двунитевых разрывов ДНК [4]. АТМ белок вместе NBS1 белком действуют как первичные сенсоры двунитевых повреждений ДНК, вызывая пострансляционные модификации других сенсоров, таких, например, как MRE11 и MDC1 [5]. Эти модифицированные сигнальные белки амплифицируют сигнал о ДНК повреждениях и передают сигнал дальше до ключевых «чекпоинтов» клеточного цикла. ATM самостоятельно способен фосфорилировать несколько ключевых белков (р21, TP53, CHK2, H2AX и др.) точек контроля клеточного цикла, следствием чего может быть арест клеточного цикла, индукция процессов ДНК репарации и апоптоза [6,7]. Отмечена специфическая активация АТМ при действии гамма-лучей [8].
Повреждения АТМ гена могут вызывать аутосомно-рецессивное заболевание – атаксию-телеангиэктазию (Ataxia telangiectasia), характеризующиеся нервной дегенерацией, гиперчувствительностью к ионизирующей радиации, ранним старением, отставанием развития, гипогонадизмом, а также повышенным риском развития онкологических заболеваний [9].
В последнее время интенсивно изучается роль однонуклеотидных полиморфизмов гена АТМ в радиочувствительности и формировании предрасположенности к раковым, аутоиммунным заболеваниям.
Известно 1523 вида полиморфизма гена АТМ, замены нуклеотидов, выпадения или вставки смысловых последовательностей, которые могут изменять функции белка [10]. Полиморфизм 1853 кодона, происходящий в результате замены G→A по 5557 положению нуклеотида, определяющей замену Asp→Asn по 1853 кодону полипептида (АТМ G5557A (Asp1853Asn)), наиболее часто ассоциируется с различными раковыми заболеваниями [11]. Целью данного исследования явилось изучение роли этого полиморфизма в радиочувствительности жителей Семипалатинского региона.
Материалы и методы
Объекты исследования. В ходе исследования были проанализированы образцы ДНК, выделенные из периферической крови людей, проживающих на территории Семипалатинского ядерного полигона и экологически благоприятных регионов Алматинской области.
Для генотипирования полиморфных аллелей АТМ G5557A были использованы:
1) 107 образцов ДНК, представляющих семьи 3 поколении, проживающие в п.п. Чаган и Бодене Восточно-Казахстанской области;
60
2) 68 образцов ДНК, представляющих семьи 3 поколении из экологически благоприятного региона Алматинской области (п. Таукаратурык);
3) 114 образцов ДНК, представляющих мужчин-ликвидаторов аварии на ЧАЭС, одновременно являющихся жителями г. Семипалатинск;
4) 56 контрольных образцов ДНК мужчин, соответствующих группе ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС из п.Уштобе, Жанаталап, Дзержинск Алматинской области.
Выделение ДНК. ДНК выделяли из замороженных (-20°С) образцов периферической крови, содержащих в качестве антикоагуляционного агента ЭДТА. Лимфоциты промывали 2-3 раза раствором 1xSSC с осаждением клеток при центрифугировании на 13000 об./мин и ресуспендированием осадка. Для экстракции ДНК использовали лизирующий буфер (0,2 М ацетат Na, 1% SDS). От белковых компонентов освобождались путем стандартной фенол-хлороформной экстракции: 1 обработка равным объемом фенола, 2 - фенол-хлороформной смесью (1:1), 1 - хлороформом. ДНК из водной фазы осаждали добавлением 2,5 объемов 96% этанола, осадок ДНК промывали 80% раствором этанола, высушивали на воздухе и растворяли в бидистиллированной воде.
Для очистки образцов от примесей РНК, в раствор ДНК добавляли РНК-азу до конечной концентрации 50 мкг/мл и инкубировали при 37°С в течение 1 часа. Образцы ДНК хранили при –20°С.
ПЦР и последующая рестрикция амплификатов. Генотипирование осуществлялось с помощью анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов продуктов амплификации (SSCP – single strand confirmation polymorhysm) с использованием специфической рестриктазы. Для ПЦР гена АТМ Asp1853Asn использовали 100 ng изолированной ДНК и соотвествующие праймеры для ПЦР:
5'-GATTCATGATATTTTACTCTAA-3´ и 5'-AAGACAGCTGGTGAAAAATC-3'.
ПЦР проводили в 20 мкл реакционной смеси. Условия ПЦР амплификации состояли из инициирующего этапа - 94°C , 2 мин; следующие 35 циклов при 95°C в течение 30 сек., температура отжига - 48°C в течение 30 сек., 72°C в течение 30 сек. с заключительным этапом при 72°C в течение 2 мин. ПЦР продукты (88-п.н.) обрабатывали рестриктазой DdeI (Fermentas). Гомозиготы по нормальному аллелю (ATM 1853 Asp/Asp) дают 2 полосы размером 69 и 19 п.н.; гетерозиготы (ATM 1853 Asp/Asn) – 3 полосы размером 88/69/19 п.н.; гомозиготы по мутантному аллелю (ATM 1853 Asn/Asn) – 1 полосу размером 88 п.н.
Статистическая обработка. Показатели относительного риска (OR), выявляющие подверженность генов репарации ДНК и детоксикации ксенобиотиков мутационным изменениям в результате действия радиации, рассчитывали по стандартной формуле:
OR =a/b x d/c,
где a - количество людей в облученной группе, имеющих мутантный генотип;
b – количество людей в облученной группе, имеющих нормальный генотип;
c – количество людей в контрольной группе, имеющих мутантный генотип;
d – количество людей в контрольной группе, имеющих нормальный генотип.
Достоверный доверительный интервал вычисляли по формулам:
CImin=exp(lnOr-1,96√(1/a+1/b+1/c+1/d)) CImax=exp(lnOr+1,96√(1/a+1/b+1/c+1/d))
Достоверность различий (Р) между группами определяли с использованием Сhi2 и t-критерия Стьюдента.
Уровень вероятностей 0.05 использовался как критерий значения.
Для анализа также были использованы программы для обработки результатов молекулярно- эпидемиологических исследований, вполненных методом «случай-контроль» [12].
Результаты и их обсуждение
Для анализа был использован материал по радиационно-облученным популяциям, собранный в ходе проекта «Пополнение, изучение и сохранение генбанков ДНК, клеток и тканей человека». Подбор контрольных образцов осуществлялся, исходя из соответствия нескольким параметрам, таких как средний возраст, пол, наличие вредных привычек, в частности курения. В таблицах 1 и 2 представлены данные по соответствию облученных и контрольных групп.
Из образцов периферической крови представителей облученных и контрольных когорт выделена ДНК и проведено генотипирование аллелей АТМ гена по полиморфизму 1853 кодона. На рисунках 1 и 2 представлены примеры определения генотипов по изучаемому виду полиморфизма АТМ гена в облученных и контрольных группах.
Таблица 1 - Cоответствие признаков облученной (пп. Бодене и Чаган Восточно-Казахстанской области) и контрольной (п. Таукаратурык Алматинской области) популяции
Пол, человек, (%) Вредные привычки, человек, (%) Популяции Средний
возраст, лет
Этническая принадлежность,
человек, (%) женский мужской Курение Алкоголь Облученная
когорта (116 чел.) 35,5 Казахи –
116 (100) 62 (53,45) 54 (46,55) 22 (18,89) 15 (12,99) Контрольная
когорта (69 чел.) 39,2
Казахи – 69 (100)
36 (52,17) 33 (47,81) 12 (17,41) 7 (10,15)
61
Таблица 2 - Соответствие признаков популяции ликвидаторов аварии на ЧАЭС (г. Семипалатинск) с контрольной когортой (п.п. Уштобе, Жанаталап, Дзержинск Алматинской области)
Этническая принадлежность, человек
(%) Вредные привычки,
человек (%)
Популяции Средний
возраст,
лет Казахи Русские и
украинцы Другие Курение Алкоголь Ликвидаторы
последствий аварии на
ЧАЭС (114 чел.) 48,6 75 (65,8) 36 (31,6) 3 (2,6) 72 (63,2) 81 (71,1) Контрольная
когорта (56 чел.) 49,2 37
(66,1) 18
(32,1) 1
(1,8) 34
(60,7) 37
(66,1)
1-14 – ДНК образцов К137 – К150; 1-4, 6 и 14 – генотип G/A; 7-11 и 13 - генотип G/G Рисунок 1 - Электрофореграмма продуктов рестрикции амплификатов гена АТМ G5557A
в образцах ДНК представителей контрольных групп
из п.п. Дзержинск, Уштобе, Жанаталап, Таукаратурык Алматинской области.
1-10 – ДНК образцов К81, К182, 80, 404, 405, 412, 416, 429, 487; 1-10 - генотип G5557G Рисунок 2 - Электрофореграмма продуктов рестрикции амплификатов гена АТМ G5557A в образцах
ДНК представителей семей из п.п. Чаган и Бодене Восточно-Казахстанской области.
Распределение генотипов в облученных популяциях соответствует распределению Харди-Вайнберга (для представителей семей из п. Бодене и Чаган - chi2=0,03, p=0.86; для ЧАЭС - chi2=0,45, p=0.5). В популяции здоровых мужчин, представляющей контроль для ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС, не было обнаружено ни одного гомозиготного по редкому аллелю (5557А) генотипа (chi2=0.0, p=1). Возможно, это связано с недостаточностью объема выборки или этнической гетерогенностью исследуемой группы. Однако и в контрольной популяции семей из п. Таукаратурык, представленной 100% казахами, также не было генотипировано гомозиготности по редкому аллелю. Поэтому сравнение частоты встречаемости редкого аллеля (5557А) АТМ гена в популяциях здоровых людей, не подвергнутых радиационному облучению, с литературными данными не представилось возможным. Примечательно, что частота распространения гетерозиготного носительства варьирует у представителей различных этнических групп. Так, для кавказцев (0,66; 0,34; 0,66-0,66), африканцы (0,27; 0,21; 0,31-0,63), испанцы (0,70; 0,21; 0,22-0,20), и для этнических групп
62
Тихого океана (0,54; 0,40; 0,56-0,60), полученные из базы данных SNP. Данные о встречаемости этого вида полиморфизма в популяциях азиатов весьма разнятся.
На рисунках 3 и 4 представлены данные по распределению генотипов по полиморфизму гена АТМ G5557A в облученных (семьи и ЧАЭС) и контрольных когортах.
Сравнивая распределение генотипов по данному виду полиморфизма в контрольных и облученных популяциях, были рассчитаны показатели относительного риска (OR, odds ratio), определяющие индивидуальную радиорезистентность или радиочувствительность в ассоциации с конкретным генотипом.
Результаты статистического анализа суммированы в таблице 3.
0 20 40 60 80 100
G/G G/A A/A
Распределение генотипов, % АТМ G5557A Облученная
популяция (семьи) Контрольная популяция (семьи)
Рисунок 4 - Распределение АТМ G5557A