ISSN 2224-5308 Серия биологическая и медицинская. № 6. 2016 N E W S
OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE REPUBLIC OF KAZAKHSTAN SERIES OF BIOLOGICAL AND MEDICAL
ISSN 2224-5308
Volume 6, Number 318 (2016), 37 – 47
V. Y. Kislitsin, A. V. Zhigailov, N. S. Polymbetova, B. K. Iskakov RSE «M. A. Aitkhozhin Institute of Molecular Biology and Biochemistry», CS MES RK,
Almaty, Kazakhstan.
E-mail: [email protected] ; [email protected]
CLONING, MUTAGENESIS AND EXPRESSION OF cDNA-GENE
подавляющего большинства эукариотических мРНК. В клетках животных и дрожжей фосфорилирование α-субъединицы eIF2 тормозит инициацию трансляции при различных стрессах. У растений роль фосфори- лирования гомологичного фактора (peIF2α) в регуляции биосинтеза белка остается невыясненной.
В настоящей работе амплифицирован и клонирован кДНК-ген α-субъединицы фактора eIF2 из Arabi- dopsis thaliana (AteIF2α(S56)). С помощью сайт-направленного in vitro-мутагенеза получены два варианта этой кДНК: AteIF2α(S56D) и AteIF2α(S56A). Вариант AteIF2α(S56D) кодирует субъединицу AteIF2α с заменой остатка серина в положении 56 на аспарагиновую кислоту, что имитирует ее конститутивно фосфо- рилированное состояние. Вариант AteIF2α(S56A) с заменой кодона серина-56 на триплет аланина кодирует нефосфорилируемую форму AteIF2α. Нативный и оба мутированных варианта кДНК-гена AteIF2α клони- рованы в векторе pET19b и экспрессированы в клетках Escherichia coli. На N-конце рекомбинантные белки содержали последовательность 10 гистидинов (10His-tag), необходимую для их выделения. Белки AteIF2α(S56), AteIF2α(S56D) и AteIF2α(S56А) выделяли методом аффинной хроматографии, диализовали и концентрировали: все они имели корректные размеры около 40 кДа. Субъединица AteIF2α(S56) способна фосфорилироваться специфической киназой mPKR в присутствии двуспиральной РНК, что указывает на ее функциональную полноценность. Эти рекомбинантные субъединицы необходимы для исследования роли фосфорилирования peIF2α в регуляции синтеза белков у растений.
Ключевые слова: фактор инициации трансляции 2 растений (peIF2), рекомбинантные α-субъединицы, клонирование, мутагенез, экспрессия, фосфорилирование.
Введение. Фактор eIF2 – белок, присутствующий во всех типах эукариотических клеток, со- стоит из трех неидентичных полипептидов, обозначаемых α, β и γ, из которых α-субъединица выполняет регуляторную функцию. Этот фактор образует с молекулой GTP и инициаторной метионил-тРНК (Met-tRNAi) тройной комплекс {GTP*eIF2*Met-tRNAi}, который связывается с 40S рибосомной субчастицей (40S-РС), образуя 43S пре-инициаторный комплекс (43S-ПИК). При взаимодействии этого комплекса с мРНК образуется 48S-ПИК, в составе которого 43S-ПИК скани- рует мРНК (в направлении 5'→3') в поисках стартового AUG-кодона, в узнавании которого прини- мают участие антикодон Met-tRNAi, факторы eIF1, eIF1A и eIF5. По достижении стартового кодо- на фактор eIF5 активирует GTP-азную активность фактора eIF2, который гидролизует молекулу GTР тройного комплекса до GDР, что приводит к высвобождению из 48S-ПИК большинства ини- циаторных факторов, присоединению 60S-РС и переходу к элонгации полипептидной цепи [1, 2].
После каждого цикла инициации фактор eIF2 высвобождается из 48S-ПИК в виде прочного бинарного комплекса {eIF2*GDP}. Для того чтобы eIF2 мог участвовать в следующем цикле, молекула GDP должна быть заменена на GTP.
В клетках млекопитающих такой обмен не может протекать самостоятельно, так как сродство фактора meIF2 к GDP на два порядка выше, чем к GTP. Обмен гуаниловых нуклеотидов может происходить только при помощи вспомогательного фактора meIF2B. Фактор meIF2B образует комплекс с {meIF2*GDP}, после чего GDP легко диссоциирует. Фосфорилирование α-субъеди- ницы meIF2 ингибирует обмен GDP→GTP, катализируемый фактором meIF2B. Фактор eIF2B не может стимулировать обмен GDP→GTP на meIF2(αP), что приводит к прекращению образования новых тройных комплексов {GTP*meIF2*Met-tRNAi}, к резкому торможению инициации транс- ляции и остановке синтеза белка в клетках млекопитающих [3, 4]. Аналогичный механизм был найден у дрожжей [1, 4] и считалось, что он функционирует также и в клетках растений.
Однако, согласно нашим данным, молекулярный механизм регуляции активности гомологич- ного фактора у растений (peIF2) существенно отличается от такового в клетках млекопитающих [5]. В частности, нами было установлено, что сродство peIF2 пшеницы к GDP лишь в 10 раз выше, чем к GTP, тогда как для meIF2 данное превышение составляет два порядка. Вследствие этого, для цикличного функционирования peIF2 растений не требуется фактор eIF2B, который строго необходим у млекопитающих. Из этих данных также следует, что при достаточно высоком соот- ношении концентраций [GTP]/[GDP] в клетках растений обмен GDP→GTP может происходить независимо от того, фосфорилирован ли peIF2 или нет [5].
Наши результаты подтверждены другими группами исследователей [6 – 9]. У растений до сих пор не обнаружена ни биохимическая активность, ни гены peIF2B-подобного фактора [8]. Кроме того, из четырех протеинкиназ (PKR, HCR, PERK, GCN2), фосфорилирующих α-субъединицу фактора meIF2 в клетках млекопитающих, у растений обнаружены активность и ген только одной pGCN2-киназы. Мутанты с поврежденным геном gcn2 вполне жизнеспособны, хотя и проявляли
ISSN 2224-5308 Серия биологическая и медицинская. № 6. 2016 повышенную чувствительность к некоторым стрессам и гербицидам, нарушающим синтез амино- кислот и пуринов [9 - 11].
Экспериментальные данные свидетельствуют, что механизм ингибирования синтеза белка посредством фосфорилирования α-субъединицы фактора peIF2 не используется у растений, находящихся в нормальных, но физиологически различных состояниях (например, днем или ночью) [13]. Фосфорилирование peIF2α не является универсальным ответом растений на все виды стрессовых воздействий. Так при солевом (250 мM NaCl) и окислительном (1 мM H2O2) стрессах [11], а также при вирусных инфекциях [10] и тепловом шоке (42° С, 2 ч) [9, 14] фосфорилирования peIF2α не наблюдалось.
Вместе с тем имеются данные, что этот механизм регуляции может работать у растений при дефиците аминокислот и пуринов, хотя и не так выраженно, как у животных [8, 10, 11]. Киназа pGCN2 может тормозить синтез белка у растений посредством фосфорилирования peIF2α (как у других эукариот) в ответ на определенные, но не все стрессовые воздействия [8 - 11]. Детали этого регуляторного механизма еще не ясны, особенно учитывая отсутствие у растений peIF2B-по- добного фактора. Требуются дополнительные экспериментальные исследования для их полного понимания.
С этой целью в данной работе нами получены рекомбинантные α-субъединицы фактора eIF2 из Arabidopsis thaliana в нативном варианте (AteIF2α(S56)), а также с заменой серина-56 на аспарагиновую кислоту (AteIF2α(S56D)) либо на аланин (AteIF2α(S56A)). Вариант AteIF2α(S56D) имитирует конститутивно фосфорилированное состояние α-субъединицы, тогда как AteIF2α(S56A) не способна фосфорилироваться. Эти рекомбинантные субъединицы необходимы для исследо- вания роли фосфорилирования peIF2α в регуляции синтеза белков у растений.
Материалы и методы исследования
В работе использовались реагенты фирм «Sigma», «Serva», «Merck», «Fermentas», «Roche»,
«Promega», «Bio-Rad» и «BioLabs» и олигодезоксирибонуклеотиды (олигоДНК или праймеры), приведенные в таблице 1.
Таблица 1 – Последовательность праймеров, использованных в данной работе Table 1 – Sequence of praims праймеров used in hired
Праймер Нуклеотидная последовательность
«eIF2-NdeI-FW» 5’GAATCATATGACCATGGCGAATCCTGCTCCGAATCTAGAATGTCGTATGT
«eIF2-BamHI-Rev» 5'TGCGGATCCTTTTGTTCATTCAATTATCCCGCTACCTCCATCGATATC
«eIF2-D-FW» 5'CTCCGAGCTCGATCGCCGTCGGATTGGTAGTAT
«eIF2-D-Rev» 5'CCGACGGCGATCGAGCTCGGAGAACAGGATCATT
«eIF2-А-FW» 5'CTCCGAGCTCGCGCGCCGTCGGATTGGTAGTAT
«eIF2-А-Rev» 5'CCGACGGCGCGCGAGCTCGGAGAACAGGATCATT
Компьютерный анализ. Анализ нуклеотидных последовательностей ДНК перед встраи- ванием их в плазмидные вектора, а также подбор праймеров для клонирования и мутагенеза про- водили с использованием компьютерных программ GenRuner 3.00, Vector NTI 8.0, RNA-struc- ture 3.5 и Blast (http://www.blast.genome.jp). Нуклеотидная последовательность гена AteIF2α была взята из базы данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Денситометрический анализ проводили с использованием компьютерной программы ImageJ v.1.42q.
Выделение РНК. Препарат тотальной РНК выделяли из листьев A. thaliana с использованием набора PARISTM («Ambion») по методике производителя.
Обратная транскрипция. Реакцию обратной транскрипции (РОТ) поводили с использо- ванием набора QuantiTect® Reverse Transcription Kit («Qiagen») по методике производителя. В качестве матрицы использовались препарат мРНК, выделенный из A. thaliana, а в качестве обрат- ного праймера – «eIF2-BamHI-Rev».
Амплификация кДНК AteIF2α. После РОТ проводили ПЦР с использованием праймеров
«eIF2-NdeI-FW» и «eIF2-BamHI-Rev» и высокоточной полимеразы Pwo («Roche») по методике производителя в следующем режиме: стадия 1 - 5 мин. при 94ºС - 1 цикл; стадия 2 - 30 сек. при 94ºС, 30 сек. при 54ºС, 1 мин. 30 сек. при 72ºС – 30 циклов; стадия 3 - 5 мин. при 72ºС – 1 цикл.
Продукты ПЦР анализировали в 1,5 % агарозном геле.
Сайт направленный мутагенез. Клонированный кДНК-ген AteIF2α мутировали методом ПЦР с использованием перекрывающихся праймеров «eIF2-NdeI-FW», «eIF2-BamHI-Rev», «eIF2- D-FW» и «eIF2-А-FW» в тех же условиях и в том же режиме, как при амплификации кДНК AteIF2α. Лигирование продуктов РОТ-ПЦР и сайт направленного мутагенеза проводили после их элюции из агарозного геля с использованием набора «DNA Gel extraction Kit» («Fermentas»).
Очищенные фрагменты ДНК были обработаны рестриктазами NdeI и BamHI и лигированы в векторе pET19b по тем же сайтам рестрикции с использованием Т4 ДНК-лигазы («Fermentas») по методике производителя. Общие методы молекулярной генетики и инженерии (трансформация клеток E. coli, выделение плазмидной ДНК, лигирование ДНК и др.) проводили согласно [15].
Секвенирование ДНК. Корректность всех конструкций проверялась их секвенированием с использованием набора «Big Dye® Terminator v.3.1» («Applied Biosystems») по методике производителя. Электрофорез проводили в капиллярах на генетическом анализаторе 310 «Applied Biosystems», а анализ полученных данных осуществляли с использованием программы
«Sequencing Analysis 5.2».
Экспрессия рекомбинантных белков. Плазмидами AteIF2α(S56)-pET19b, AteIF2α(S56D)- pET19b и AteIF2α(S56A)-pET19b были трансформированы клетки экспрессионных штаммов E. coli BL21 и LysStar по стандартной методике. Клетки растили в 200 мл жидкой среды LB при 30 ºС до оптической плотности OD600=0,5, осаждали при 4000 g в течение 3 мин, ресуспендировали в 200 мл свежей среды LB, содержащей IPTG до конечной концентрации 1 мМ, и культивировали при 30 ºС в течение 4 часов.
Выделение и анализ рекомбинантных белков. Белки, содержащие 10His-tag, выделяли в нативных и денатурирующих условиях методом аффинной хроматографии IMAC (immobilized me- tal ion affinity chromatography) с использованием набора «PerfectPro Ni-NTA Agarose» («5-Prime») по методике производителя.
Электрофорез белков проводили в полиакриламидном (ПАА) геле (T = 12,5%, C = 0,5%) в присутствии 0,1% додецилсульфата натрия (SDS) по стандартной методике [16]. Гели окрашивали 0,125% раствором Кумасси бриллиантового синего R-250 («Serva»).
Перенос белков из ПАА-геля на нитроцеллюлозную мембрану проводили в аппарате для полусухого блотинга (''C.B.S. Scientific'') в буфере для переноса (102 мМ глицина, 25 мМ Трис, 20% (о/о) этанола) при силе тока 0,8 мА см2 в течение 1 часа. Мембрана после переноса промыва- лась дважды по 10 мин в буфере TBS (20 мМ ТрисHCl (pH=7,6), 140 мМ NaCl), дважды по 10 мин – в буфере TBST (TBS + 0,05% Tween-20) и инкубировалась в блокирующем буфере (7% сухое молоко «Frima» на TBSТ) в течение ночи при 4ºС. После этой обработки мембрану инкубировали с первыми антителами (Penta-His mouse antibodies («5-Prime») в разведении 1:2000 в блокирующем буфере) в течение 1 часа при комнатной температуре. После трехкратной промывки в TBSТ по 20 мин мембрану инкубировали со вторыми антителами (Anti-mouse HRP-conjugate («5-Prime») в разведении 1:2000 в блокирующем буфере) в течение 1 часа при комнатной температуре. После двукратной промывки мембраны по 20 мин в TBST и двукратной промывки по 10 мин в TBS, про- водили реакцию с хемилюминесцентным субстратом для пероксидазы фирмы «Promega» по методике производителя.
Для удаления из раствора белков имидазола или мочевины проводили диализ с использованием диализных мешков («Sigma») против буфера (20 мМ TrisAc pH7,6; 90 мМ КАс; 2 мМ Mg(ОAc)2) в течение ночи при температуре 4 ºС. Концентрирование белков после диализа проводилось путём центрифугирования образцов в колонках с мембраной “10,000 MWCO HY” («Sartorius»). Концен- трацию белков определяли по Бредфорду [17] в трех повторах с вычислением среднего арифме- тического значения (Xср) и ошибки среднего арифметического (m).
ISSN 2224-5308 Серия биологическая и медицинская. № 6. 2016 Результаты и их обсуждение
Согласно нуклеотидной последовательности мРНК AteIF2α (GeneBank №: NM_120629.3) были подобраны соответствующие праймеры для амплификации, клонирования и мутагенеза этой кДНК. Посредством РОТ-ПЦР была получена и амплифицирована кДНК AteIF2α (см. дорожку 1 на рисунке 1), которую клонировали в векторе pET19b по сайтам рестрикции NdeI и BamHI с полу- чением конструкции AteIF2α(S56)-pET19b.
М – ДНК-маркер; 1 – продукт РОТ-ПЦР кДНК AteIF2α(S56); 2 – ПЦР-продукт “Head-D”; 3 – ПЦР-продукт “Tail-D”;
4 – ПЦР-продукт, соответствующий кДНК AteIF2α(S56D); 5 – ПЦР-продукт “Head-A”; 6 – ПЦР-продукт “Tail-A”;
7 – ПЦР-продукт, соответствующий кДНК AteIF2α(S56A).
Рисунок 1 – Электрофоретический анализ в 1,5% агарозном геле продуктов ПЦР, образующихся в ходе сайт-направленного мутагенеза кДНК AteIF2α
M – DNA marker; 1 – RT-PCR product of cDNA AteIF2α (S56); 2 – PCR product "Head-D"; 3 – PCR product "Tail-D";
4 – PCR product corresponding to cDNA AteIF2α (S56D); 5 – PCR product "Head-A"; 6 – PCR product "Tail-A"; 7 – PCR product corresponding to cDNA AteIF2α(S56A).
Figure 1 – Electrophoretic analysis in 1.5% agarose gel of PCR products generated during site-directed mutagenesis of AteIF2α cDNA
Известно, что один из механизмов торможения синтеза белков в клетках млекопитающих состоит в фосфорилировании серина-51 у α-субъединицы фактора meIF2 (соответствует серину-56 у peIF2α из A. thaliana) специфическими протеинкиназами, что приводит к резкому ингибиро- ванию биосинтеза белка [3, 4, 8, 9].
Для детального исследования роли фосфорилирования α-субъединицы фактора peIF2 из A. thaliana необходимо получить не только исходный вариант кДНК-гена AteIF2α (AteIF2α(S56)), но также еще две мутированные ее формы:
– AteIF2α(S56D), кодирующую форму AteIF2α, которая имитирует постоянно фосфорили- рованное состояние;
– AteIF2α(S56А); кодирующую нефосфорилируемую форму AteIF2α.
Для этого ТСТ-кодон, кодирующий серин в положении 56 AteIF2α, необходимо было заме- нить на GAT-кодон, кодирующий аспарагиновую кислоту (в случае AteIF2α(S56D)), либо на GCG- кодон, кодирующий аланин (в случае AteIF2α(S56А)). Сайт-направленный мутагенез проводили методом ПЦР с перекрывающимися праймерами, суть которого заключается в том, что для внесе- ния мутации используются два праймера (прямой и обратный), перекрывающиеся в месте мутаге- неза, и содержащие соответствующие нуклеотидные замены.
На первом этапе в качестве матрицы использовали кДНК AteIF2α(S56) с парой прай- меров «eIF2-NdeI-FW»/«eIF2-D-Rev» (в случае кДНК AteIF2α(S56D)), либо парой праймеров
«eIF2-NdeI-FW»/«eIF2-A-Rev» (в случае кДНК AteIF2α(S56А)). Продукты ПЦР размером 200 п.о.
(соответственно «eIF2-D-Head» и «eIF2-А-Head») элюировали из агарозного геля (дорожки 2 и 5 на рисунке 1).
На втором этапе в качестве матрицы использовали кДНК AteIF2α(S56) с парой прай- меров «eIF2-D-FW»/«eIF2-BamHI-Rev» (в случае кДНК AteIF2α(S56D)), либо парой праймеров
«eIF2-A-FW»/«eIF2-BamHI-Rev» (в случае кДНК AteIF2α(S56А)). Продукты ПЦР размером 892 п.о.
(соответственно «eIF2-D-Tail» и «eIF2-А-Tail») элюировали из агарозного геля (дорожки 3 и 6 на рисунке 1).
Для третьего этапа ПЦР в качестве матриц использовали элюированные продукты ПЦР, полученные в ходе первых двух этапов, а в качестве праймеров в обоих случаях – «eIF2-NdeI-FW»
и «eIF2-BamHI-Rev». ПЦР-продукты размером 1063 п.о. (дорожки 4 и 7 на рисунке 1), вырезали из геля, элюировали, обрабатывали рестриктазами NdeI и BamHI и клонировали в векторе pET19b, обработанном теми же рестриктазами. В итоге были получены ДНК-конструкции AteIF2α(S56D)- pET19b и AteIF2α(S56A)-pET19b.
Схематическое изображение полученных ДНК-конструкций с указанием сайтов рестрикции показано на рисунке 2.
Lac – lac-оператор; rbc – участок связывания прокариотических рибосом (последовательность Шайна-Дальгарно);
10-His – последовательность, кодирующая 10 остатков гистидина; EK – нуклеотидная последовательность, кодирующая сайт распознавания энтерокиназы для отрезания 10His-tag от рекомбинантного белка.
Рисунок 2 – Схематическое представление полученных ДНК-конструкций AteIF2α(S56)-pET19b, AteIF2α(S56D)-pET19b и AteIF2α(S56A)-pET19b
Lac – lac-operator; rbs – prokaryotic ribosome binding site (Shine-Dalgarno sequence); 10-His – sequence encoding 10 his- tidine residues; EK – nucleotide sequence that encodes enterokinase recognition site, which is required for removal of 10His-tag from recombinant protein.
Figure 2 – Schematic presentation of obtained DNA constructs AteIF2α(S56)-pET19b, AteIF2α(S56D)-pET19b and AteIF2α(S56A)-pET19b
Чтобы удостовериться в корректности введенных мутаций, а также в том, что в ходе клонирования не произошло случайных изменений клонируемых кДНК, функциональные участки всех ДНК-конструкций были секвенированы.
ДНК-конструкциями AteIF2α(S56)-pET19b, AteIF2α(S56D)-pET19b и AteIF2α(S56A)-pET19b были трансформированы клетки экспрессионного штамма E. coli Bl-21. После экспрессии реком- бинантных генов синтезированные белки выделяли за 10His-tag методом аффинной хромато- графии IMAC. Препараты рекомбинантных субъединиц очищали диализом, после чего их кон- центрировали методом центрифугирования в колонках “Sartorius” с мембраной, проницаемой лишь для молекул по массе меньше 10 кДа. Электрофоретический и вестерн-блот анализ препа- ратов рекомбинантных белков до и после концентрирования приведен на рисунке 3.
Концентрирование рекомбинантных белков в образцах происходило более чем в 3,5 раза.
Результаты денсиметрического анализа геля и измерения концентрации белков, в препаратах, выделенных в нативных условиях после их концентрирования представлены в таблице 2.
Поскольку количество интактного белка, выделенного в нативных условиях было небольшим, то рекомбинантный белок AteIF2α(S56) выделяли также и в денатурирующих условиях. Такой препарат был использован для получения антител к этому белку. Выделенные препараты белков анализировали электрофорезом в 12,5% ПАА-геле, результаты которого приведены на рисунке 4.
ISSN 2224-5308 Серия биологическая и медицинская. № 6. 2016
А – 12,5% ПАА-гель, окрашенный Кумасси G250; Б – иммуноблотинг нитроцеллюлозной мембраны с использо- ванием в качестве первых антител Mouse Penta-His Antibodies (“5-Prime”).
Дорожки: 1 – AteIF2α(S56) до концентрирования; 2 – AteIF2α(S56D) до концентрирования; 3 – AteIF2α(S56А) до концентрирования; 4 – AteIF2α(S56) после концентрирования; 5 – AteIF2α(S56D) после концентрирования; 6 – AteIF2α(S56А) после концентрирования; М – белковый маркер Page Ruler Plus.
Рисунок 3 – Электрофореграмма (А) и вестерн-блот анализ (Б) препаратов рекомбинантных белков, выделенных в нативных условиях
A – 12.5% PAA-gel stained with Coomassie G250; B – immunoblotting of nitrocellulose membrane using Mouse Penta-His ("5-Prime") as the first antibodies.
Tracks: 1 – AteIF2α (S56) before the concentration; 2 – AteIF2α (S56D) before the concentration; 3 – AteIF2α (S56A) be- fore the concentration; 4 – AteIF2α (S56) after concentration; 5 – AteIF2α (S56D) after concentration; 6 – AteIF2α (S56A) after concentration; M – protein marker Page Ruler Plus.
Figure 3 – Electrophoregram (A) and western blot analysis (B) of recombinant protein preparations isolated under native conditions
Таблица 2 – Концентрация рекомбинантных субъединиц AteIF2α в препаратах белков, выделенных в нативных условиях Table 2 – Concentration of AteIF2α recombinant subunits in preparations of proteins extracted under native conditions
Белок Protein
Общая концентрация белка по Бредфорду
(мкг/мл) The total concentration of proteins by Bredford
(mkg/ml)
Доля интактного AteIF2α в препарате, % The part of intact
AteIF2α in preparation, %
Концентрация интактного AteIF2α
(мкг/мл) The concentration
of intact AteIF2α in preparation (mkg/ml)
Общее количество интактного AteIF2α
(мкг) The total amount of intact AteIF2α in preparation (mkg)
AteIF2α(S56) 548,2 ± 22,1 12,6 69,1 276,4
AteIF2α(S56D) 552,3 ± 12,5 12,8 70,7 282,8
AteIF2α(S56A) 554,9 ± 15,0 13,4 74,4 297,6
Из данных, представленных на рисунке 4 видно, что даже по сравнению с концентрирован- ным препаратом AteIF2α(S56), выделенным в нативных условиях (дорожка 5 на рисунке 4), некон- центрированные препараты AteIF2α(S56), выделенные в денатурирующих условиях, имели значи- тельно большую концентрацию (1150,3 мкг/мл против 548,2 мкг/мл) и более высокое содержания полноразмерного белка AteIF2α(S56) (53% против 12,6%).
Чтобы проверить, способна ли рекомбинантная субъединица AteIF2α(S56), выделенная в на- тивных условиях, фосфорилироваться специфической киназой по остатку серин-56 (Ser56), ее инкубировали с рекомбинантной киназой HsPKR человека в присутствии poly(I/C) – аналога двуспиральной (дс)РНК, которая является активатором киназы. Продукты реакции анализировали электрофорезом, после чего проводили иммуноблотинг с использованием коммерческих антител против фосфорилированной формы HseIF2α(Р). Результаты анализа представлены на рисунке 5.
Дорожки: 1-4 – препараты AteIF2α(S56), выделенные в денатурирующих условиях без концентрирования; 5 – скон- центрированный препарат AteIF2α(S56), выделенный в нативных условиях.
М – маркерные белки PageRuler Plus, размеры которых указаны слева.
Рисунок 4 – Электрофоретический анализ в 12,5% ПАА-геле препаратов рекомбинантного белка AteIF2α(S56), выделенных в денатурирующих условиях
Lanes: 1-4 – preparations of AteIF2α(S56), isolated under denaturing conditions without concentration; 5 – concentrated AteIF2α (S56) isolated under native conditions. M - protein marker PageRuler Plus («Life science»).
Figure 4 – Electrophoretic analysis in 12.5% PAA gel of recombinant protein AteIF2α(S56) preparations isolated under denaturing conditions
М – белковый маркер PageRuler («Life science»). Дорожки: 1 – AteIF2α; 2 – AteIF2α + poly(I/C); 3 – AteIF2α + + poly(I/C) + HsPKR.
Рисунок 5 – Фосфорилирование рекомбинантной субъединицы AteIF2α(S56) специфической PKR-киназой (HsPKR) в присутствии аналога дсРНК poly(I/C)
М – Protein ladder PageRuler (“Life science”). Lines: 1 – AteIF2α; 2 – AteIF2α + poly(I/C); 3 – AteIF2α + poly(I/C) + HsPKR.
Figure 5 – Phosphorylation of recombinant AteIF2α(S56) subunit by specific HsPKR-kinase in the presence of dsRNA-analog poly (I/C)
Как видно из данных, представленных на рисунке 5, выделенная рекомбинантная субъединица AteIF2α(S56) в присутствии дсРНК специфически фосфорилировалась HsPKR-киназой очевидно по остатку Ser56, который соответствует остатку Ser52 в субъединице HseIF2α человека, что подтверж- дает физиологическую активность выделенного белка. Мутированные субъединицы AteIF2α(S56D) и AteIF2α(S56A) не могли служить субстратом для фосфорилирования киназой HseIF2α.
ISSN 2224-5308 Серия биологическая и медицинская. № 6. 2016 Имеющиеся в настоящее время данные о функционировании фактора инициации трансляции у эукариот и архей позволяют предположить, что кроме известного у животных и грибов блоки- рования фактора eIF2B в комплексе {Met-tRNA*eIF2*GTF*eIF2B} существует более древний механизм регуляции трансляции с участием фактора eIF2, функционирующий у архей и растений, а также, возможно, сохранившийся у животных и грибов. О существовании иного механизма регуляции может свидетельствовать эксперимент, подтверждающий фосфорилирование aIF2α по остатку Ser48 животной PKR-киназой и её архейным гомологом Ph0512p [18], а также тот факт, что у архей, как и у растений, не обнаружены гомологи каталитического субкомплекса eIF2Bγε и регуляторного субкомплекса eIF2Bαβδ. Более того, у архей пока так и не обнаружены гомологи eIF5 [19], а β-субъединица aIF2 не имеет характерного для эукариот N-концевого домена, с кото- рым связываются eIF5 и eIF2Bε. Было показано, что aIF2 имеет одинаковое сродство к GDP и GTP, и их обмен так же как у растений происходит без участия дополнительных факторов [20].
По нашему мнению, альтернативный механизм регуляции трансляции через фосфорилиро- вание eIF2α происходит путём образования стрессовых гранул. В экспериментах in vivo было показано, что в клетках растений и животных фосфорилирование eIF2α является необходимым условием для сборки стрессовых гранул [21, 22]. Стрессовые гранулы представляют собой дис- кретные включения нетранслируемых мРНК и различных белков, обладающих мРНК связываю- щим свойством. К настоящему времени известно, что в состав стрессовых гранул входят факторы инициации трансляции eIF2, eIF3, eIF4E, поли(А)-связывающий белок, 40S рибосомная субчас- тица, TIA-1/R и другие белки [22].
В настоящей работе мы клонировали кДНК-ген AteIF2α, получили варианты этой кДНК, кодирующие мутированные формы белка AteIF2α (не фосфорилируемую и фосфомиметическую) с заменой Ser56 на Ala56 или Asp56 соответственно. Выделили рекомбинантные белки AteIF2α(S56), AteIF2α(S56D) и AteIF2α(S56A) аффинной хроматографией. Препараты белков были очищены и сконцентрированы. Нативная и мутированные рекомбинантные субъединицы AteIF2α необходимы для изучения роли фосфорилирования eIF2α у растений. Согласно нашим предварительным дан- ным, рекомбинантные субъединицы могут входить в состав фактора peIF2, что позволяет изучать влияние внесенных в них мутаций на активность peIF2 в системах in vitro и in vivo.
Финансирование. Работа выполнена в рамках грантовых проектов: 1920/ГФ4 «Исследование регуля- ции трансляции мРНК у растений посредством фосфорилирования альфа-субъединицы фактора инициации 2 (peIF2α)» и 4538/ГФ4 «Разработка биотехнологии создания генетически модифицированных растений кар- тофеля с повышенной устойчивостью к абиотическим стрессам на основе оптимизации экспрессии мути- рованных вариантов трансгена AteIF2α».
ЛИТЕРАТУРА
[1] Hinnebusch A.G., Lorsch J.R. The mechanism of eukaryotic translation initiation: New insights and challenges // Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. – 2012. – Vol. 4.
[2] Hinnebusch A.G. Molecular mechanism of scanning and start codon selection in eukaryotes // Microbiology and Molecular Biology Reviews. – 2011. – Vol. 75. – P. 434-467.
[3] Baird Th.D., Wek R.C. Eukaryotic initiation factor 2 phosphorylation and translational control in metabolism //
Advances in Nutrition. – 2012. – Vol. 3. – P. 307-321.
[4] Wortham N.C., Proud Ch.G. eIF2B: recent structural and functional insights into a key regulator of translation //
Biochemical Society Transactions. – 2015. – Vol. 43. – P. 1234-1240.
[5] Shaikhin S.M., Smailov S.K., Lee A.V., Kozhanov E.V., Iskakov B.K. Interaction of wheat germ translation initiation factor 2 with GDP and GTP // Biochimie. – 1992. – Vol. 74. – P. 447-454.
[6] Janaki N., Krishna V.M., Ramaiah K.V.A. Phosphorylation of wheat germ initiation factor 2 (eIF-2) by N-ethyl- maleimide-treated wheat germ lysates and by purified casein kinase II does not affect the guanine nucleotide exchange on eIF-2 //
Archives of Biochemistry and Biophysics. – 1995. – Vol. 324. – P. 1-8.
[7] Krishna, V. M., Janaki, N., Ramaiah, K. V. A. Wheat germ initiation factor 2 (WG-eIF2) decreases the inhibition in pro- tein synthesis and eIF2B activity of reticulocyte lysates mediated by eIF2a phosphorylation // Archives of Biochemistry and Biophysics. – 1997. – Vol. 346. – P. 28-36.
[8] Immanuel T.M., Greenwood D.R., MacDiarmid R.M. A critical review of translation initiation factor eIF2α kinases in plants – regulating protein synthesis during stress // Functional Plant Biology. – 2012. – Vol. 39. – P. 717-735.
[9] Browning K.S., Bailey-Serres J. Mechanism of cytoplasmic mRNA translation // The Arabidopsis Book. – 2015. – e0176 - P.1-39. – http://dx.doi.org/10.1199/tab.0176.
[10] Zhang Y., Wang Y., Kanyuka K., Parry M.A.J., Powers S.J., Halford N.G. GCN2-dependent phosphorylation of eukaryotic translation initiation factor-2α in Arabidopsis // Journal of Experimental Botany. – 2008. – Vol. 59. – P. 3131-3141.