• Ешқандай Нәтиже Табылған Жоқ

БИОЛОГИЯЛЫҚ ҒЫЛЫМДАР

УДК 579.86

ВЫДЕЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ, ПЕРСПЕКТИВНЫХ ДЛЯ РАЗРАБОТКИ ЗАКВАСОК ПРЯМОГО ВНЕСЕНИЯ

Нағызбекқызы Э., PhD Молдагулова А.К., Сембаева Д.Ж.

Хасенова Э.Ж., магистр Молдагулова Н.Б., к.в.н, PhD ТОО «Экостандарт.kz», пр. Кабанбай батыра,53 г. Астана, 010000, Казахстан, elvira_29.04@mail.ru Аннотация

Объектом данного исследования служили 36 молочнокислых бактерий, выделенных из различных кисломолочных продуктов. Целью работы являлось выделение молочнокислых бак- терий, перспективных для разработки заквасок прямого внесения и их идентификация. Всего выделено 36 молочнокислых бактерий, в результате оценки жизнеспособности культур микроор- ганизмов отобрано 19 активных изолятов для дальнейших исследований. Проведена фено- и ге- нетическая идентификация культур МКБ. В результате генотипирования бактерий путем анали- за последовательности гена 16S rRNA отобранные изоляты были относены к родам Lactobacillus, виды casei, paracasei, fermentum, curieae, oryzae; Pediococcus, виды acidilactici, pentosaceus;

Enterococcus, виды faecium, lactis; Weissella, вид confusa. Проведенная генетическая идентифи- кация на основе фрагмента ITS региона показала, что 2 культуры были идентифицированы как Saccharomyces cerevisiae и Saccharomyces lactis.

Ключевые слова: молочнокислые бактерий, Lactobacillus, Pediococcus, Enterococcus, Weis- sella, Saccharomyces, закваски прямого внесения, идентификация, 16S rRNA.

Современная биотехнология неразрывно связана с использованием новых подходов к отбору природных микроорганизмов при соз- дании заквасок и бактериальных препаратов для молочной промышленности [1]. Одним из направлений современной биотехнологии яв- ляется защита и улучшение здоровья человека.

Молочнокислые бактерии (МКБ) относятся к группе микроорганизмов, которые являются основой для создания заквасок и пробиоти- ческих препаратов, которые положительно влияют на желудочно-кишечный тракт и в це- лом здоровье человека. Они используются не только в медицине, но и в пищевой промыш- ленности, в частности молочной, участвуя в процессе производства и поддержке свежести продукта и одновременно снижают потреб- ность в использовании искусственных кон- сервантов [2]. Своеобразное специфическое управление биохимическими процессами во внутренней среде организма осуществляется кисломолочными продуктами, получаемыми с помощью молочнокислых микроорганизмов.

При их недостатке происходит заселение ки- шечника патогенными и условно-патогенными микроорганизмами [3]. Для получения молоч- нокислых продуктов стерилизованное молоко или сливки сквашивают путем внесения чи- стых культур. Они носят название «стартовых заквасок». В зависимости от типа закваски получают разные продукты. Например, такие как сметана, творог и творожные изделия, про- стокваша, кефир, кумыс, шубат, курт и т.д.

Традиционно к МКБ относят пред- ставителей отряда Lactobacillales. Наиболь- шую практическую ценность для использо- вания имеют бактерии, относящиеся к родам Bifidobacterium, Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Pediococcus и Leuconostoc. Ме- зофильные лактобациллы, такие, как L. casei, L.

rhamnosus, чаще всего используются в произ- водстве кисломолочных напитков и йогуртов как дополнительный заквасочный компонент.

Считается, что род Lactococcus, тесно ассоци- ированный с производством пищевых продук- тов, является одним из самых значимых среди

них [4]. Выделение уникальных культур МКБ со значимым пробиотическим эффектом явля- ется актуальной задачей современной биотех-

нологии. В связи с этим, целью данной работы являлось выделение МКБ, перспективных для разработки заквасок прямого внесения.

Методы и объекты исследования Исследования проводились на базе ком- пании ТОО «Экостандарт.kz». Объектами ис- следований служили культуры МКБ, выделен- ные из различных кисломолочных продуктов домашнего и заводского приготовления.

Исследования включали выделение, изу- чение жизнеспособности и идентификация на основе физиолого-биохимических характери- стик культур МКБ, а также генотипирования по фрагменту гена 16S rRNA (для бактерий) и ITS региона (для дрожжей).

Для культивирования бактерий исполь- зовались питательные селективные среды MRS с различной концентрацией агара – жид- кие, плотные (2%), и c различной концентраци- ей водородных ионов (рН 5,0; 7,0). В качестве посевного материала использовали 24-х часо- вые культуры 3-й генерации. рН определялось потенциометрически с помощью мембранного рН-метра.

Для отбора среди выделенных изолятов жизнеспособных культур, была дана оцен- ка максимального показателя ЖСП. Нами

был использован метод серийных разведений Miles&Misra. Посевы инкубировались в тече- ние 48 часов. Количество колоний подсчитыва- ли по двум последним разведениям, в которых наблюдался рост молочнокислых бактерий.

Идентификацию на основе физиолого- биохимических характеристик культур микро- организмов проводили по общепринятым в бактериологической практике методам с ис- пользованием определителей [5-10]. Родовую идентификацию лактобацилл определяли с помощью таксономической классификации Квасникова Е.И. и Нестеренко О.А. [6]. Гено- типирование проводили с помощью амплифи- кации фрагмента 16S rRNA гена и ITS региона (для дрожжей).

Молочнокислые микроорганизмы, ко- торые непосредственно использовали в иссле- дованиях, поддерживали и сохраняли в виде пробирочных культур одной генерации. Куль- туры хранили в герметично закрытом виде в холодильнике при + 4–8С.

Выделение молочнокислых микроорга- низмов проводили из кисломолочных продук- тов домашнего приготовления, в основном из свежего верблюжьего, кобыльего, коровьего и козьего молока различных регионов Казах- стана; из кисломолочных продуктов, пред- ставленных на рынке Казахстана (заводского приготовления отечественного производства);

заквасок различных кисломолочных продук- тов (домашнего и заводского приготовления).

В работе были использованы пробы пре- имущественно из домашних хозяйств Южно- Казахстанской, Западно-Казахстанской, Кы- зылординской, Актюбинской, Акмолинской, Карагандинской, Костанайской и Северо-Ка- захстанской областей.

Также для выделения микроорганизмов были исследованы жидкие закваски «Желмая»

для шубата производства КХ «Абылай», село Саналы, ЮКО, закваска домашнего приготов- ления для шубата (Кызылординская обл.).

Выделение культур осуществлялось с использованием специальных сред, предназна- ченных для молочнокислых бактерий с инку-

бацией при 37°С и 50°С в течение двух суток в микроаэрофильных условиях.

Общее число исследованных образцов составило 45, что позволило выделить 36 куль- тур молочнокислых бактерий.

Предварительную идентификацию бак- терий проводили традиционным способом на основе морфологических, физиологических и биохимических свойств.

При определении культуральных при- знаков МКБ отмечается, что одни характери- зовались ростом на агаризованной среде MРС в виде поверхностных круглых колоний с чет- кими краями (S-формы), белого или кремово- го цвета, диаметры варьировали от мелких до крупных (рисунок 1А, Б). Другие (рисунок 1В, Г) образовывали крупные шероховатые коло- нии (R-формы), с неровными краями, белого цвета, часто с уплотненным центром.

Рост данных бактерий в бульоне MRS ха- рактеризуется тремя разновидностями: равно- мерное помутнение питательной среды вдоль столбика или с прозрачным кольцом сверху виде пленки, среда остается прозрачной, ха- Результаты исследований и обсуждение

рактерен пристеночный рост. Во всех случаях образуется осадок большей или меньшей ин- тенсивности.

Культуральные характеристики МКБ представлены на рисунке 1.

А Б

В Г

Рисунок 1 – Рост колоний выделенных МКБ на среде МРС-4 По микроморфологии чистые культуры

были отнесены к бактериям рода Lactobacillus по следующим характеристикам: неспороо- бразующие, разнообразны по форме, коккоо- бразные нитевидные палочки различной дли- ны, расположенные единично или цепочками, грамположительные. Неподвижные, каталазо- отрицательные.

Бактерии рода Lactococcus при микро- скопии представлены неподвижными кокками, не образующими спор, хорошо окрашиваются анилиновыми красителями и по Граму, грам- положительные, имеют форму стрептококка.

Диаметр кокковых форм от 0,6 до 1 мкм, рас- полагаются единично, парами или в виде цепо- чек различной длины.

По морфологической характеристи- ке: грамположительные дрожжевые клетки, круглые, овальные, лимоновидные, крупные, размеры варьируют от мелких до крупных, микроорганизмы были отнесены к дрожжевым грибам.

На рисунке 2 представлены варианты микроскопической картины МКБ (лактоба- цилл, лактококков и дрожжей).

а б

в г

а – короткие палочки расположены одиночно, скоплениями и цепочками; б – тонкие палочки расположены одиночно, пачками; в – кокки расположены скоплениями, пачками, местами еди-

ничные, г – грамположительные дрожжевые клетки в виде зерна, овальные, крупные Рисунок 2 – Микроскопическая картина МКБ

Примечание – Окраска по Граму; световая иммерсионная микроскопия; ×1000 Всего из 36 изолятов МКБ, лактобацилл

было 19, кокков – 11, а дрожжей – 6.

Согласно изученным фенотипическим характеристикам, большинство из выде- ленных нами культур предварительно были

идентифицированы как Lactococcus lactis – 25%, вторым по численности видом являл- ся Saccharomyces cerevisiae – 16,7%, далее Lactobacilus fermentum, salivarius, casei – 8,3%

(рисунок 3).

Рисунок 3 – Разнообразие МКБ по фенотипическим признакам

В процессе изучения культур, выделен- ных из домашних и заводских продуктов, было выявлено, что МКБ одного и того же вида от- личались по способности сбраживания угле- водов. Это указывает на то, что МКБ избира- тельны к условиям культивирования и составу питательных сред. В зависимости от этого они могут изменять свои культурально-морфоло- гические признаки и терять некоторые биохи- мические способности, а именно, сбраживать отдельные виды сахаров.

Создание технологий биойогуртов на ос- нове живых микроорганизмов – одно из самых сложных направлений в биотехнологии, основ- ной задачей которых является получение мак-

симального количества жизнеспособных кле- ток. Поэтому далее изучали жизнеспособность клеток молочнокислых микроорганизмов. Со- гласно требованиям, в 1 г продукта на конец срока годности титр клеток должен составлять не менее 107 КОЕ/г. Оптимальными цифрами при отборе пробиотических микроорганизмов является максимальный показатель ЖСП 107 КОЕ/мл и более. Особый интерес представля- ют бактерии, выделенные из кисломолочных продуктов домашнего приготовления и вер- блюжьего молока. В результате изучения жиз- неспособности клеток, для дальнейшей работы нами были отобраны 19 культур МКБ, имею- щие допустимый показатель ЖСП (таблица 1).

Таблица 1 – Жизнеспособность выделенных культур МКБ п/н№ Культура Титр клеток,

lg КОЕ/cм3

п/н Культура Титр клеток, lg КОЕ/cм3

1 Ш 1-1 7,08±0,12 11 Ш 2-11 7,48±0,19

2 Ш 1-2 7,48±0,17 12 Ш 2-12 8,18±0,25

3 Ш 1-3 7,77±0,05 13 Ш 2-16 7,7±0,1

4 Ш 1-4 8,18±0,21 14 Ш 2-17 8,48±0,14

5 Ш 1-5 7,6±0,18 15 Ш 2-18 7,48±0,23

6 Ш 1-6 8,84±0,02 16 Ш 2-20 7,78±0,15

7 Ш 1-7 8,7±0,23 17 Ш 2-21 8,78±0,31

8 Ш 1-8 8,48±0,12 18 Ш 2-23 7,65±0,27

9 Ш 1-9 7,6±0,11 19 Ш 2-24 7,6±0,1

10 Ш 2-10 7,48±0,13

Далее проводили генетическую иденти- фикацию исследуемых культур микроорганиз- мов методом изучения прямой нуклеотидной

последовательности фрагмента гена 16S rRNA, а также фрагмента ITS региона. Результаты ге- нотипирования приведены в таблице 2.

Таблица 2 – Результаты генетической идентификации МКБ п/н№ Обозначение

изолятов Полученный

результат №

п/н Обозначение

изолятов Полученный

результат 1 L-001 Enterococcus faecium 11 L-011 Pediococcus pentosaceus 2 L-002 Pediococcus acidilactici 12 L-012 Pediococcus pentosaceus 3 L-003 Lactobacillus curieae 13 L-013 Lactobacillus fermentum 4 L-004 Lactobacillus casei 14 L-014 Weissella confusa

5 L-005 Enterococcus lactis 15 L-015 Weissella confusa

6 L-006 Lactobacillus oryzae 16 L-016 Weissella confusa 7 L-007 Lactobacillus paracasei 17 L-017 Saccharomyces lactis 8 L-008 Weissella confusa 18 L-018 Saccharomyces cerevisiae 9 L-009 Pediococcus pentosaceus 19 L-019 Weissella confusa 10 L-010 Pediococcus pentosaceus

В результате генотипирования путем ана- лиза последовательности гена 16S rRNA стало известно, что отобранные изоляты относятся

к родам Lactobacillus, виды casei, paracasei, fermentum, curieae, oryzae; Pediococcus, виды acidilactici, pentosaceus; Enterococcus, виды

faecium, lactis; Weissella, вид confusa. Прове- денная генетическая идентификация методом определения прямой нуклеотидной последова- тельности фрагмента ITS региона (для дрож- жей) показала, что 2 культуры были иденти- фицированы как Saccharomyces cerevisiae и

Saccharomyces lactis.

Таким образом, для проведения даль- нейших исследований нами были отобра- ны 5 штаммов бактерий рода Lactobacillus, 5 штаммов рода Pediococcus и 2 штамма рода Saccharomyces.

Выводы

В результате проведенных работ, нами выделено 36 культур МКБ из различных кисло- молочных продуктов домашнего и заводского приготовления, в основном из свежего верблю- жьего, кобыльего, коровьего и козьего молока различных регионов Казахстана. На основе идентификации по физиолого-биохимическим

характеристикам и генетической идентифи- кации по гену 16S rRNA и ITS региона, вы- деленные культуры были отнесены к группам молочнокислых бактерий рода Lactobacillus, Pediococcus, Enterococcus, Weissella и дрож- жам рода Saccharomyces.

Список литературы

1 Шурхно Р.А., Вологин С.Г., Гибадуллина Ф.С., Тагиров М.Ш. Скрининг природных штаммов молочнокислых бактерий и их таксономическая идентификация // Современные про- блемы науки и образования. - 2015. - №2-1.; URL: http://www.science-education.ru/ru/article/

view?id=21189 (дата обращения: 25.08.2018).

2 Сливка І.М., Цісарик О.Й., Боцер Т. Ідентифікація молочнокислих бактерій із застосу- ванням комплексу молекулярно-генетичних методів // Науковий вісник ЛНУВМБТ імені С.З.

Ґжицького - 2014. –Т. 16. № 3(60) Частина 2, - С. 280-289.

3 Magnusson J., Ström K., Roos St., Sjögren J., Schnürer J. Broad and complex antifungal activity among environmental isolates of lactic acid bacteria // FEMS Microbiology Letters. – 2003. – Vol. 219.

– P. 129–135.

4 Щетко В.А., Фещенко В.Ю. Выделение молочнокислых бактерий, перспективных для пищевой промышленности, с целью последующей их идентификации // Природа. - 2015. - №2. - C. 42-48.

5 ГОСТ 10444.11-88: Продукты пищевые. Методы определения молочнокислых микроор- ганизмов. – М.: Издательство стандартов, 2002. – 14 с.

6 Квасников Е.И., Нестеренко О.Л. Молочнокислые бактерии и пути их использования. - М.:Наука, 1975. - 389 с.

7 Краткий определитель бактерий Берги / Под ред. Дж. Хоулта. - М.:Мир, 1980. – С. 287- 294. 8Ильенко-Петровская Т.П., Бухтарева Э.Ф. Товароведение пищевых жиров, молока и мо- лочных товаров: учебник для торг. вузов. – М.: Экономика, 1980. – 304 с.

9 Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии. – М.:

Дрофа, 2004. – 256 с.

10 Практикум по микробиологии / под ред. А.И. Нетрусова. – М.: Академия, 2005. – 608 с.

References

1 Shurhno R.A., Vologin S.G., Gibadullina F.S., Tagirov M.Sh. Skrining prirodnyh shtammov molochnokislyh bakterij i ih taksonomicheskaja identifikacija [Screening of natural strains of lactic acid bacteria and their taxonomic identification], Sovremennye problemy nauki i obrazovanija [Modern problems of science and education], (2/1), (2015). Available at: http://www.science-education.ru/ru/

article/view?id=21189 [in Russian]. (accessed: 25.08.2018).

2 Slivka І.M., Cіsarik O.J., Bocer T. Іdentifіkacіja molochnokislih bakterіj іz zastosuvannjam kompleksu molekuljarno-genetichnih metodіv [Identification of lactic acid bacteria and its complexion of molecular genetic methods], Naukovij vіsnik LNUVMBT іmenі S.Z. Ґzhic'kogo [Scientific herald of

LNUWMBT named after S.Z. Gzhytsky], 16(3/60), 280-289 (2014). [in Russian]

3 Magnusson J., Ström K., Roos St., Sjögren J., Schnürer J. Broad and complex antifungal activity among environmental isolates of lactic acid bacteria // FEMS Microbiology Letters. – 2003. – Vol. 219.

– P. 129–135.

4 Shhetko V.A., Feshhenko V.Ju. Vydelenie molochnokislyh bakterij, perspektivnyh dlja pishhevoj promyshlennosti, s cel'ju posledujushhej ih identifikacii [Isolation of lactic acid bacteria, promising for the food industry, with a view to their subsequent identification], Priroda [Nature]. (2), 42-48 (2015). [in Russian]

5 GOST 10444.11-88: Produkty pishhevye. Metody opredelenija molochnokislyh mikro- organizmov [Food products. Methods for the determination of lactic acid microorganisms], Izdatel'stvo standartov [Publishing house of standards], P 14 (2002). [in Russian]

6 Kvasnikov E.I., Nesterenko O.L. Molochnokislye bakterii i puti ih ispol'zovanija [Lactic acid bacteria and ways of using them], Nauka [Science], P 389 (1975). [in Russian]

7 Kratkij opredelitel' bakterij Bergi [Brief determinant of bacteria Bergi], Pod red. Dzh. Houlta. - Mir [Ed. J. Houlta. -The World], P 287-294 (1980). [in Russian]

8 Ilyenko-Petrovsky T.P., Bukhtareva E.F. Tovarovedeniye pishchevykh zhirov, moloka i molochnykh tovarov: uchebnik dlya torg. vuzov. [Commodity science of food fats, milk and dairy products: a textbook for bargaining. universities], Ekonomika [Economy], P 304 (1980). [in Russian]

9 Tepper Ye.Z., Shil'nikova V.K., Pereverzeva G.I. Praktikum po mikrobiologii. [Workshop on microbiology], Drofa [Drofa], P 256 (2004). [in Russian]

10 Praktikum po mikrobiologii / pod red. A.I. Netrusova [Workshop on Microbiology / Ed. A.I.

Netrusova], Akademiya [Academy], P. 608 (2005). [in Russian]

ТІКЕЛЕЙ ЕНГІЗІЛЕТІН АШЫТҚЫЛАРДЫ ДАЙЫНДАУҒА АРНАЛҒАН СТАРТЕРЛІК КУЛЬТУРАЛАРДЫ БӨЛІП АЛУ

Э. Нағызбекқызы, PhD А.К. Молдағұлова

Д. Ж. Сембаева Э.Ж. Хасенова, магистр Н.Б. Молдағұлова, в.ғ.к., PhD

«Экостандарт. kz» ЖШС, Қабанбай батыр даңғ., 53 Астана қ., 010000, Қазақстан, elvira_29.04@mail.ru Түйін

Зерттеудің объектісі ретінде әр түрлі ферменттелген сүт өнімдерінен бөлініп алынған 36 сүтқышқылды бактериялар болды. Жұмыстың мақсаты тікелей енгізілетін ашытқыларды дайындауға пайдаланылатын сүтқышқылды бактерияларды бөліп алу және идентификаци- ялау болып табылады. Барлығы 36 сүтқышқылды бактериялар бөлініп алынды, скрининг нәтижесі бойынша 19 белсенді изолят іріктелді. Сүтқышқылды бактерияларға фенотиптік және генетикалық идентификация жүргізілді. 16S рРНК генінің арнайы бөлігін талдау арқылы бактериялық генотиптіліктің нәтижесінде іріктелген изоляттар Lactobacillus туыстығына, оның ішінде casei, paracasei, fermentum, curieae, oryzae түрлеріне; Pediococcus туыстығына, оның ішінде acidilactici, pentosaceus түрлеріне; Enterococcus туыстығына, faecium, lactis түрлеріне, Weissella туыстығына, confusa түрлеріне жататындығы анықталды. ITS аймағының фрагменті негізінде генетикалық сәйкестендіру 2 культураны Saccharomyces cerevisiae және Saccharomyces lactis ретінде анықталғанын көрсетті.

Кілттік сөздер: сүтқышқылды бактериялар, Lactobacillus, Pediococcus, Enterococcus, Weissella, Saccharomyces, тікелей енгізілетін ашытқылар, сәйкестендіру, 16S rRNA.

ISOLATION OF LACTIC ACID BACTERIA, PROMISING AS STARTER

CULTURES FOR THE DEVELOPMENT OF FERMENTS FOR DIRECT APPLICATION E. Nagyzbekkyzy, PhD

A.K. Moldagulova D.Zh. Sembaeva E.Zh. Khasenova,master N.B. Moldagulova, k.v.s., PhD LLP "Ecostandard.kz", Kabanbai batyr avenue, 53 Astana, 010000, Kazakhstan, elvira_29.04@mail.ru Summary

The object of this study was 36 lactic acid bacteria isolated from various fermented milk products.

The purpose of the work was to isolate lactic acid bacteria that are promising as starter cultures for ferments of direct application and their identification for the development of starter cultures for direct application. A total of 36 lactic acid bacteria were isolated, 19 active isolates were selected for screening as a result of the screening. Phenotypical and genetic identification of LAB cultures was carried out.

As a result of bacterial genotyping by analysis of the sequence of the 16S rRNA gene, the selected isolates were related to genera Lactobacillus, species casei, paracasei, fermentum, curieae, oryzae;

Pediococcus acidilactici, pentosaceus; Enterococcus, species of faecium, lactis, Weissella, species of confusa. Genetic identification based on the ITS region fragment showed that 2 cultures were identified as Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces lactis.

Keywords: lactic acid bacteria, Lactobacillus, Pediococcus, Enterococcus, Weissella, Saccharomyces, starter cultures, identification, 16S rRNA.

УДК:619.579.841.94:612.015.1:615.074(045)

ПОЛУЧЕНИЕ ШТАММА ПРОДУЦЕНТА РЕКОМБИНАНТНОГО БВМ19 BRUCELLA ABORTUS И ИЗУЧЕНИЕ ЕГО АНТИГЕННОСТИ

А.К. Булашев, К.А. Турсунов, Ж.К. Каирова, А.С. Сыздыкова Казахский агротехнический университет им. С.Сейфуллина, пр. Жеңіс, 62

г. Астана, 010011, Казахстан, aytbay57@mail.ru Аннотация

В статье представлены результаты исследований по созданию штамма продуцента реком- бинантного белка внешней мембраны (БВМ) с молекулярной массой 19 кДа (рБВМ19) Brucella abortus и изучению антигенности целевого продукта. Рекомбинантный белок находился в тель- цах включения цитоплазмы штамма-продуцента Е. coli BL21(DE3), который давал максимальное количество целевого продукта при культивировании его в течение суток. Проведены сравнитель- ные исследования сывороток крови крупного рогатого скота (КРС), положительно реагирующе- го на бруцеллез по классическим серологическим реакциям, в непрямом иммуноферментном анализе (н-ИФА) на основе рБВМ19, рБВМ25 и рБВМ31, а также природных БВМ бруцелл.

Сделано заключение о том, что использование единичного рекомбинантного белка в н-ИФА зна- чительно снижает его чувствительность, поэтому эффективные диагностикумы могут быть раз- работаны на основе применения комплекса белковых антигенов.

Ключевые слова: бруцеллез, белки внешней мембраны, рекомбинантные белки, антиген- ность, н-ИФА, диагностика.