ВЕТЕРИНАРЛЫҚ ҒЫЛЫМДАР - ҒЫЛЫМ ЖАРШЫСЫ ВЕСТНИК НАУКИ № 3(98)

УДК:619.579.841.94:612.015.1:615.074(045)

ПОЛУЧЕНИЕ ШТАММА ПРОДУЦЕНТА РЕКОМБИНАНТНОГО БВМ19 BRUCELLA ABORTUS И ИЗУЧЕНИЕ ЕГО АНТИГЕННОСТИ

А.К. Булашев, К.А. Турсунов, Ж.К. Каирова, А.С. Сыздыкова Казахский агротехнический университет им. С.Сейфуллина, пр. Жеңіс, 62

г. Астана, 010011, Казахстан, [email protected] Аннотация

В статье представлены результаты исследований по созданию штамма продуцента реком- бинантного белка внешней мембраны (БВМ) с молекулярной массой 19 кДа (рБВМ19) Brucella abortus и изучению антигенности целевого продукта. Рекомбинантный белок находился в тель- цах включения цитоплазмы штамма-продуцента Е. coli BL21(DE3), который давал максимальное количество целевого продукта при культивировании его в течение суток. Проведены сравнитель- ные исследования сывороток крови крупного рогатого скота (КРС), положительно реагирующе- го на бруцеллез по классическим серологическим реакциям, в непрямом иммуноферментном анализе (н-ИФА) на основе рБВМ19, рБВМ25 и рБВМ31, а также природных БВМ бруцелл.

Сделано заключение о том, что использование единичного рекомбинантного белка в н-ИФА зна- чительно снижает его чувствительность, поэтому эффективные диагностикумы могут быть раз- работаны на основе применения комплекса белковых антигенов.

Ключевые слова: бруцеллез, белки внешней мембраны, рекомбинантные белки, антиген- ность, н-ИФА, диагностика.

Клетки Е.coli выращивали на жидкой или агаризованной среде Лоурия-Бертани (ЛБ), состоящей из 1% бакто-триптона, 0,5%

дрожжевого экстракта и 1% NaCl.

Поиск последовательности, кодирую- щей белок внешней мембраны бруцелл БВМ19, проводили с использованием баз данных NCBI PubMed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed) и NCBI GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

genbank). Биоинформатические исследования и планирование генно-инженерных работ про- водили с использованием пакета программ Vector NTI 11.5 (Invitrogen, США).

Белки внешней мембраны бруцелл. Для сравнительной оценки рБВМ19 использова- ли полученные нами ранее рекомбинантные рБВМ25 и рБВМ31 [17]. Кроме того, были ис- пользованы природные БВМ выделенные из клеток B. abortus 19 по методике, описанной Шенжановым К.Т. и соавт. (2002) [18]. Содер- жание белков определяли по общеизвестной методике (M.Bradford, 1975) [19].

Сыворотки. Образцы сывороток крови 77 гол. КРС, положительно реагирующего на бруцеллез по результатам классических реак- ций, были любезно представлены ветеринар- ной лабораторией Житикаринского района, Костанайской области.

Трансформация хемокомпетентных клеток Е. coli DH5α. Для наработки препара- тивного количества нуклеотидной последова- тельности, кодирующей БВМ19, полученную конструкцию трансформировали в клетки Е.coli DH5α. Для этого, компетентные клет- ки размораживали на льду в течение 30 ми- нут. Затем добавляли 2 мкл БВМ19/pET28b+

и инкубировали еще 30 минут на льду. Далее помещали пробирку на 30 секунд в водяную баню при 42°С, после чего перенесли в лед на 1-5 минут. К полученной смеси добавляли 1 мл питательной среды 2Х YT и инкубирова- ли при 37°С, 150 об/мин, в течение 40 минут.

После инкубации центрифугировали пробирку при комнатной температуре в течение 5 минут, 5000 об/мин. Надосадочную жидкость удаля- ли, оставляя около 100 мкл, осадок ресуспен- дировали и высевали на селективную среду с канамицином (50 мкг/мл). Чашки Петри инку- бировали при 37°С в течение ночи.

Для выявления положительных клонов, проводили скрининг выросших колоний ме- тодом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием коммерческих праймеров T7.

Положительную колонию нарабатывали мето- дом культивирования в 100 мл ЛБ/канамицин при 37°С, 150 об/мин, в течение ночи. Затем осаждали культуру клеток центрифугировани- ем при 4°С, 6000 об/мин, в течение 10 минут.

Надосадочную жидкость удаляли, а осадок использовали для выделения плазмиды. Плаз- миду выделяли с помощью коммерческого на- бора HiPure Plasmid Midiprep Kit (Вильнюс, Литва).

Трансформация электрокомпетентных клеток Е. coli BL21(DE3). Для определения экспрессии рекомбинантного белка получен- ную плазмиду трансформировали в электро- компетентные клетки. Для этого, клетки раз- мораживали на льду 15 минут, добавляли 2 мкл плазмиды (50 нг/мкл) и переносили в охлаж- денную кювету. Выбирали режим пульса EC-2 (V=2500). Тщательно протирали поверхность кюветы, помещали в туннель электропаратора и сделали один пульс. Затем добавляли в кюве- ту 950 мкл среды 2X-YT, переносили содержи- мое в пробирку и инкубировали 45 минут при 37°С, 150 об/мин. 50 мкл клеточной суспензии высевали на селективную среду с канамици- ном (50 мкг/мл). Чашки Петри инкубировали при 37°С в течение ночи. Для определения по- ложительного клона повторяли ПЦР скрининг с использованием коммерческих праймеров Т7. Положительную колонию нарабатывали в 50 мл ЛБ/канамицин и сохраняли криоконсер- вацией.

Определение экспрессии рБВМ19. Вы- росшими колониями инокулировали колбу, со- держащую 100 мл среды ЛБ с добавлением ка- намицина до 50 мкг/мл. Культуру выращивали при 37°С до OП600 = 0,6-0,8. Затем индуциро- вали экспрессию рекомбинантного белка до- бавлением ИПТГ до 0,5 мМ. После добавления индуктора температуру инкубации снижали до комнатной температуры (24-26°С) и продол- жали культивирование, отбирая пробы (5 мл) через 2 ч, 4 ч, 6 ч, после индукции в течение ночи и через 24 ч. Собранные пробы обрабаты- вали следующим образом. Биомассу бактерий собирали центрифугированием (6000 об/мин, 10 мин, 4°С) и разрушали с помощью ультра- звукового дезинтегратора, следуя рекоменда- циям производителя прибора. Полученный ли- зат осветляли центрифугированием (11000 об/

мин, 30 мин). По 3 мкл каждого осветлённого лизата использовали для приготовления проб для электрофореза в полиакриламидном геле в

присутствии додецилсульфата натрия (ПААГ- ДСН).

Анализ белков в ПААГ-ДСН. Электрофо- рез с исходным лизатом, растворимой и нерас- творимой фракций проводили в 12% ПААГ- ДСН по методу U.Laemmli на аппарате для вертикального электрофореза (Bio-Rad, США) [20]. Тщательно промытые и обезжиренные стеклянные пластины (7×10) монтировали с помощью прокладок и зажимов. Заливали про- странство между пластинками раствором для разделяющего геля, состоящего из 3,5 мл 30%

акриламида; 3,1 мл 1% бисакриламида; 7,5 мл 1,5 М трис HCl (рН 8,7); 6,5 мл дистиллирован- ной воды; 0.03 мл 10% ДСН; 0.001 мл ТЕМЕД и 0.01 мл 10% персульфата аммония. После по- лимеризации нижнего геля заливали оставше- еся пространство раствором для концентрации геля, приготовленного по следующей прописи:

1 мл 30% акриламида; 1 мл 1% бисакриламида;

2,5 мл 0,5 М трис-HCl (рН 6,8); 5,35 мл дистил- лированной воды; 0,01 мл 10% ДСН; 0,005 мл ТЕМЕД и 0,05 мл 10 % персульфата аммония.

Сразу же после заливки концентрирующего геля устанавливали гребенку до полной поли- меризации.

Буфер для разведения образцов готовили следующим образом: к 0,315 мл 1М трис-HCl (рН 6,8) добавляли 0,25 мл 2-меркаптоэтанола;

0,5 мл глицерина, 0,115мл 10% ДСН; 0,05 мл 0,1% бромфенолового синего и доводили объ- ем до 5 мл дистиллированной водой. Образцы разводили в соотношении 1:1, кипятили на во- дяной бане в течение 3-5 минут и охлаждали.

Электрофорез проводили при силе тока

20 мА на камеру. По завершении процесса гель вынимали из пластин, окрашивали в течение 1 часа в растворе Кумасси R-250 и отмывали в нескольких сменах обесцвечивающего раство- ра до полного исчезновения фоновой окраски.

Очистка и хроматография рБВМ19. Ре- комбинантный белок очищали с помощью ме- талл-аффинной хроматографии с использова- нием коммерческих колонок HisTrap Columns (GE Healthcare Life Sciences, Cardiff, UK) в со- ответствии с наставлениями производителя.

Определение антигенности рБВМ19 ме- тодом н-ИФА. Лунки 96-луночного планшета иммобилизовали рБВМ19 в концентрации 1 мкг/мл, растворенным в бикарбонатном буфе- ре, pH 9,6. Планшет инкубировали при 4°С, в течение ночи и промывали 3 раза фосфатно-со- левым буфером (ФСБ), pH 7,4. Далее вносили исследуемые образцы сыворотки крови в зара- нее установленном оптимальном разведении и инкубировали 1 час при 37°С. После повто- рения процедуры промывки, вносили по 100 мкл/лунку антивидовые антитела (anti-bovine), меченные пероксидазой хрена (Sigma-Aldrich, США) в рабочем разведении. Инкубировали 1 час при 37°С и промывали ФСБ. Реакцию про- являли добавлением субстрата ортофенилен- диамин (ОФД) и останавливали 2,5 М H2SO4.

Оптическую плотность (ОП) измеряли на спектрофотометре, при длине волны 492 нм.

Результат н-ИФА считали положительным, если значение ОП исследуемого образца пре- вышало экстинцию контрольной пробы в 2 и более раза.

"MGISKASLLSLAAAGIVLAGCQSSRLGNLDNVSPPPPPAPVNAVPAGTVQKGNLDSPTQFPN APSTDMSAQSGTQVASLPPASAPDLTPGAVAGVWNASLGGQSCKIATPQTKYGQGYRAGPL RCPGELANLASWAVNGKQLVLYDANGGTVASLYSSGQGRFDGQTTGGQAVTLSR"

1 atgggaattt caaaagcaag tctgctcagc ctcgcggcgg ctggcattgt cctggccggg 61 tgccagagct cccggcttgg taatctcgat aatgtttcgc ctccgccgcc gcctgcaccg 121 gtcaatgctg ttccggcagg cacggtgcag aaaggcaatc ttgattctcc cacacaattc 181 cccaatgcgc cctccacgga tatgagcgcg caatccggca cacaggtcgc aagcctgccg 241 cctgcatccg caccggacct gacgcccggc gccgtggctg gcgtctggaa cgcctcgctt 301 ggtggtcaga gctgcaagat cgcgacgccg cagaccaaat atggccaggg ctatcgcgca

Результаты исследований

Для создания генетической конструк- ции, служащей основой для экспрессии ре- комбинантного антигена, нами был проведен анализ международной базы данных Genbank и отобрана наиболее оптимальная последо- вательность гена, кодирующего БВМ19 B.

abortus.

Ниже представлена полная аминокис- лотная последовательность данного белка, а также нуклеотидная последовательность его гена, состоящая из 567 п.н.

361 ggcccgctgc gctgccccgg tgaactggct aatcttgcct cctgggccgt caatggcaag 421 caactcgtcc tttacgatgc gaacggcggt acggttgcct cgctctattc ttcaggacag 481 ggccgcttcg atggccagac caccggcggg caggccgtga cgctgtcgcg ctga

Приведенная нуклеотидная последова- тельность была синтезирована компанией Bio Basic (Канада) и получена в лиофилизирован- ном виде в концентрации 4 мкг. По рекоменда- ции производителя полученные образцы ДНК были растворены в 40 мкл воды mQ. Разведен- ные образцы хранили при – 20°С.

В результате проведенной работы нами была получена генетическая конструкция на основе вектора pET28b+, включающая в себя последовательность гена, кодирующего необ- ходимый белок, а также 6His-Tag, применяе-

мый при очистке и изоляции белкового компо- нента из общей бактериальной массы.

Для дальнейших работ плазмида, не- сущая последовательность гена БВМ19, была трансформирована в компетентные клетки E.

сoli DH5α для получения препаративного ко- личества плазмиды.

Для определения наличия трансформи- рованных генов был проведен ПЦР-скрининг колоний с чашки Петри (рисунок 1). В каче- стве праймеров использовали Т7 Forward и Т7 Revers.

1-4 – колонии; 5 – отрицательный контроль; 6 – положительный контроль №1;

7 – положительный контроль №2; 8 – ДНК маркер Рисунок 1 – Электрофореграмма ПЦР продуктов Как видно из рисунка 1, трансформация

прошла успешно. Длина гена БВМ19 составля- ет около 870 п.н., что соответствует ожидаемо- му размеру.

Для дальнейшей работы колонию №1 скалывали на большой объем селективной пи- тательной среды (ЛБ/канамицин, 50 мкг/мл), культивировали в течение ночи при 37°С и по- качивании в режиме 150 об/мин. Затем выде- ляли плазмиды из культуры клеток.

С целью получения штамма-продуцента рекомбинантного белка полученная конструк- ция была трансформирована в клетки E. coli штамма BL21 методом электропарации. Для определения наличия трансформированного

гена был проведен ПЦР-скрининг нескольких колоний с каждой чашки Петри. Определение вставки производили с помощью вышеописан- ной методикой постановки ПЦР.

Полученный штамм-продуцент куль- тивировали при температуре 37°С до опти- ческой плотности 0,6-0,8 при длине волны 600 нм. Далее, добавляли изопропил-β-D-1- тиогалактопиранозид (ИПТГ) и инкубировали при 24-26°С, 150 об/мин. Индукция проходи- ла в течение ночи при концентрация ИПТГ 0,5 мМ. Ниже приведены электрофореграммы белков клеток штамма-продуцента рБВМ19 (рисунок 2).

А – Общий спектр белков, Б – Белки в надосадочной жидкости, В – Белковый спектр телец включения: 1 – до добавления ИПТГ; 2 – 2 часа после добавления ИПТГ; 3 – 6 часов после добавления ИПТГ; 4 – в течение ночи после добавления ИПТГ; 5 – 24 часа после добавления

ИПТГ; М – маркерные белки

Рисунок 2 - Электрофорез лизата клеток, экспрессирующие рБВМ19 Как видно из рисунка 2, рекомбинант-

ный белок локализуется во фракции телец включения. Наибольшее количество белка на- блюдается при культивировании в течение 24 часов. Размер индуцированного белка был ра- вен 20 кДа.

Для металл аффинной хроматографии использовали коммерческие колонки HisTrap Columns. В качестве образца брали фракцию надосадочной жидкости III, с содержанием 8 М мочевины, полученную при очистке (рису- нок 3).

1 – Надосадочная жидкость III, 2 – Надосадочная жидкость прошедшая через колонку, 3 – Про- мывка колонки, 4 – 50 мМ ИПТГ I, 5 – 50 мМ ИПТГ II, 6 – 150 мМ I, 7 – 150 мМ II, 8 – Фрак-

ция I (500 мМ ИПТГ), 9 – Фракция II (500 мМ ИПТГ), 10 – Фракция III (500 мМ ИПТГ), 11 – Фракция IV (500 мМ ИПТГ), М – маркерные белки

Рисунок 3 - Электрофорез фракций рБВМ19 после хроматографии Как видно из рисунка 3, не весь белок

остался в колонке. Часть белка прошла во фракцию надосадочной жидкости прошедшей через колонку и поэтому мы наблюдаем малое количество очищенного рекомбинантного белка в лунках 8 и 9 (Фракция I и Фракция II, соответсвенно). Для получения очищенного рБВМ19 необходимо провести дальнейшие

исследования по оптимизации методики этой работы.

Антигенность рБВМ19 изучали методом н-ИФА с использованием сывороток 77 голов КРС, положительно реагирующего на бруцел- лез по результатам традиционных реакций (РБП и РА).

Таблица 1 – Результаты серологических исследований сывороток КРС в н-ИФА

Кратность ОПи/ОПк

Белковые антигены бруцелл, использованные в н-ИФА

рБВМ19 рБВМ25 рБВМ31 БВМ B.

abortus Количество исследованных голов

до 1,49* 20 6 12 3

от 1,50 до 1,99* 27 29 6 2

от 2,00 до 2,50** 22 23 9 3

от 2,51 до 3,00** 3 11 8 2

от 3,01 до 3,50** 2 5 20 -

от 3,51 до 4,00** 2 2 10 3

от 4,00 и выше** 1 1 12 65

Количество серопозитивных

животных, гол. 30 42 59 73

Средний показатель

ОПи/ОПк 2,56±0,13 2,55±0,08 3,5±0,12 6,63±0,23

Примечания:

1) ОПи - ОП исследуемой пробы; ОПк - ОП контрольной пробы;

2) * - Значения кратности ОПи/ОПк, принятые за отрицательный результат;

3) **- Значения кратности ОПи/ОПк, принятые за положительный результат.

Как видно из таблицы 1, наибольшее ко- личество серопозитивных животных (73 гол., или 94,8%) отмечается при использовании в н-ИФА БВМ B. abortus. Далее идут рБВМ31 – 59 гол. (76,6%) и рБВМ25 – 42 гол. (54,5%).

Антитела по отношению к рБВМ19 были об- наружены в образцах сывороток крови 30 гол.

(39%). Причем, сыворотки крови 8 гол., или

10,4%, давали наиболее интенсивную окраску реакционной жидкости, о чем свидетельствуют значения кратности ОПи/ОПк (2,5 и выше).

Степень корреляции между результата- ми н-ИФА при использовании рекомбинант- ных и природных БВМ бруцелл приведена в таблице 2.

Таблица 2 – Коэффициент корреляции между результатами н-ИФА с использованием различных белковых антигенов бруцелл

Изучаемые

признаки рБВМ19 рБВМ25 рБВМ31 БВМ B.abortus

Коэффициенты корреляции (r)

рБВМ19 1,0 0,45 0,18 0,24

рБВМ25 0,45 1,0 0,43 0,04

рБВМ31 0,18 0,43 1,0 -0,12

БВМ B. abortus 0,24 0,04 -0,12 1,0

Из таблицы 2 следует, что между ре- зультатами н-ИФА/рБВМ19 и н-ИФА/рБВМ25 наблюдается умеренная положительная связь (значение модуля коэффициента корреляции = 0,45). В 53 (68,8%) случаях результаты указан- ных вариантов иммуноанализа совпадали, в 18 (23,4%) случаях положительные результаты от- мечались только по н-ИФА/Omp25, а в 6 (7,8%) - только по н-ИФА/Omp19. Умеренная корреля- ция установлена и между показаниями н-ИФА с использованием рБВМ25 и рБВМ31 (r=0,43).

Корреляционная зависимость между н-ИФА/

рБВМ19 и остальными его двумя варианта- ми (н-ИФА/БВМ B. abortus и н-ИФА/рБВМ31) была слабой (r=0,24) и очень слабой (r=0,18).

Положительные и отрицательные результаты н-ИФА/БВМ19 и н-ИФА/рБВМ31 совпадали в 24 (31,2%) и 13 (16,9%) случаях, соответствен- но. рБВМ19 не детектировал антитела в сыво- ротке крови 35 гол.(45,5%), показавших поло- жительные реакции на рБВМ31. Тем не менее, следует отметить, что рБВМ19 выявил противо- бруцеллезные антитела в образцах крови 5 гол.

(6,5%), отрицательных по н-ИФА/рБВМ31.

В последнее десятилетие внимание ис- следователей, занимающихся совершенство- ванием серодиагностики бруцеллеза живот- ных, привлекают БВМ возбудителя болезни, поскольку они более специфичны для бакте- рий рода Brucellа, чем ЛПС - основной ан- тигенный компонент традиционных тестов.

Кроме того, наработка БВМ, во-первых, ме- нее опасна, чем приготовление ЛПС, предус- матривающее работу с бактериальной куль- турой; во-вторых, использование для этой цели рекомбинантных белков позволяет стан- дартизировать антиген(ы), используемый(ые) в современных высокочувствительных тестах.

Небезынтересен и тот факт, что антителообра- зование на белковые антигены часто запазды- вает по сравнению на ЛПС, и характерно для животных, у которых развивается активная бруцеллезная инфекция [21]. Таким образом, идентификация белковых компонентов бру- целл, которые вызывают антительный ответ у большинства инфицированных животных, важна не только в целях совершенствования диагностикумов, но и в разработке новых вак- цинных препаратов. В настоящее время до- вольно интенсивно исследуется возможность использования белков бруцелл 3-ей группы (рБВМ25, рБВМ28 и рБВМ31) в серодиагно- стике бруцеллеза животных. Однако, до сих пор диагностическая ценность минорных бел- ков, в том числе БВМ19, остается слабоизу- ченной.

В ходе выполнения данной работы нами был разработан дизайн генно-инженерной конструкции и осуществлен синтез нуклео- тидной последовательности гена БВМ19, про- ведено клонирование генов в состав плазми- ды (pET28b+) для экспрессии белка и создан штамм-продуцент E. coli BL21(DE3)/рБВМ19, а также отработаны оптимальные параметры индукции целевого продукта. Рекомбинант- ный белок имел мол.м. 20 кДа и находился в

Обсуждение полученных результатов и заключение

тельцах включения цитоплазмы штамма-про- дуцента, который давал максимальное коли- чество белка при культивировании в течение суток.

Данные серологических исследований показали, что результаты исследований КРС с помощью традиционных реакций (РА и РБП) в максимальной степени подтверждались по- казаниями н-ИФА/БВМ B. abortus (94,8%), тогда как иммуноанализ на основе рБВМ31, рБВМ25 и рБВМ19 обнаруживал анти-Brucella антитела в меньшем количестве поголовья (76,6%, 54,5% и 39,0%, соответственно). Высо- кую чувствительность н-ИФА/БВМ B. abortus мы объясняем низкой специфичностью данно- го варианта, поскольку использованный в нем антигенный препарат, выделенный из клеток бруцелл химическим методом, также не лишен ЛПС, которые, как известно, являются причи- ной кросс-реакций между грамотрицательны- ми бактериями.

Полученный нами рБВМ19 по анти- генности уступал двум остальным рекомби- нантным белкам. Показания н-ИФА/рБВМ19 умеренно коррелировали с результатами иммуноанализа на основе рБВМ31 и/или рБВМ25. Однако, необходимо подчеркнуть, что рБВМ19 позволил выявить анти-Brucella антитела в пробах сывороток крови от 6 до 8%

поголовья, давших отрицательные результаты при применении в н-ИФА двух остальных ре- комбинантных белков. Эти факты свидетель- ствую о том, что использование единственного рекомбинантного белка заметно снижает чув- ствительность иммунанализа. Следовательно, наиболее эффективные диагностикумы могут быть разработаны на основе применения ком- плекса (коктейля) рекомбинантных белков.

Достигнутые результаты указывают на акту- альность дальнейших исследовании по ком- бинированному использованию рБВМ19 и рБВМ25 и рБВМ31 в н-ИФА.

Список литературы

1 Corbel M.J., Elberg S.S., Cosivi O. Brucellosis in humans and animals // Geneva: World Health Organization. – 2006. – P.13-21.

2 OIE. Bovine Brucellosis Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. World Organisation for Animal Health. (2009).

3 Yongqun H. Analyses of Brucella pathogenesis, host immunity, and vaccine targets using systems biology and bioinformatics // Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. – 2012. – Vol.2.

doi:10.3389/fcimb.2012.00002.

4 Baldi P.C., Giambartolomei G.H., Goldbaum F.A., Abdon L.F., Velikovsky C.A., Kittelberger R., Fossati C.A. Humoral immune response against lipopolysaccharide and cytoplasmic proteins of Brucella abortus in cattle vaccinated with B. abortus S19 or experimentally infected with Yersinia enterocolitica serotype O:9 // Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. – 1996. – Vol.3. – P.472-476.

5 Velasco J., Romero C., López-Goñi I., Leiva J., Díaz R., Moriyón I. Evaluation of the relatedness of Brucella spp. and Ochrobactrum anthropi and description of Ochrobactrum intermedium sp. nov., a new species with a closer relationship to Brucella spp // International journal of systematic bacteriology.

– 1998. – Vol.48. – P.759-768.

6 Blasco J.M., Molina-Flores B. Control and eradication of Brucella melitensis infection in sheep and goats // Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. – 2011. – Vol.27. – P.95-104.

7 Godfroid J., Nielsen K., Saegerman C. Diagnosis of brucellosis in livestock and wildlife //

Croatian Medical Journal. – 2010. – Vol.51. – P.296-305.

8 Nielsen K., Yu W. Serological diagnosis of brucellosis // Prilozi. – 2010. – Vol.31. – P.65-89.

9 Poester F.P., Nielsen K., Samartino L.E., Yu W.L. Diagnosis of brucellosis // Open Veterinary Science Journal. – 2010. – Vol.4. – P.46-60. doi: 10.2174/1874318801004010046.

10 Ghasemi A., Salari M.H., Zarnani A.H., Pourmand M.R., Ahmadi H., Mirshafiey A., Jeddi- Tehrani M. Immune reactivity of Brucella melitensis – vaccinated rabbit serum with recombinant Omp31 and DnaK proteins // Iranian Journal of Microbiology. – 2013. – Vol.5. – P.19-23.

11 Lim J.J., Kim D.H., Lee J.J., Kim D.G., Min W., Lee H.J., Rhee M.H., Chang H.H., Kim S. Evaluation of Recombinant 28 kDa Outer Membrane Protein of Brucella abortus for the Clinical Diagnosis of Bovine Brucellosis in Korea // Journal of Veterinary Medical Science. – 2012. – Vol.74.

– P.687-691.

12 Simborio H.L.T., Lee J.J., Reyes A.W.B., Hop H.T., Arayan L.T., Min W., Lee H.J., Yoo H.S., Kim S. Evaluation of the combined use of the recombinant Brucella abortus Omp10, Omp19 and Omp28 proteins for the clinical diagnosis of bovine brucellosis // Microbial Pathogenesis. – 2015. – Vol.83-84. – P.41-46.

13 Xi Bao, Yu Fen, Zi Mian, Yi Xue, Za Zhi. Expression and identification of eukaryotic expression vectors of Brucella melitensis lipoprotein OMP19 // Chinese journal of cellular and molecular immunology. – 2016. – Vol.32. – P.470-478.

14 Mohammadi E., Golchin M. Detection of Brucella abortus by immunofluorescence assay using anti outer membrane protein of 19 kDa antibody // Adv. Clin. Exp. Med. – 2018. – Vol.27. – P.643-648.

doi: 10.17219/acem/85081.

15 Tadepalli G., Singh A.K., Balakrishna K., Murali H.S., Batra H.V. Immunogenicity and protective efficacy of Brucella abortus recombinant protein cocktail (rOmp19+rP39) against B. abortus 544 and B. melitensis 16M infection in murine model // Mol Immunol. – 2016. – Vol.71. – P.34-41. doi:

10.1016/j.molimm.2016.01.001.

16 Abkar M., Lotfi A.S., Amani J., Eskandari K., Ramandi M.F., Salimian J., Brujeni G.N., Alamian S., Kamali M., Koushki H. Survey of Omp19 immunogenicity against Brucella abortus and Brucella melitensis: influence of nanoparticulation versus traditional immunization // Vet. Res.

Commun. – 2015. – Vol.39. – P.217-228. doi: 10.1007/s11259-015-9645-2.

17 IFA-test na osnove rekombinantnogo belka vneshney membrany vozbuditelya brutselleza:

otchet o NIR (promezhutochnyy) / KazATU im S.Seyfullina: ruk. Bulashev A.K.; ispoln.: Kiyan V.S., i dr. -2016. - 85s. -№ Gosregistratsii: 0115RK02413. - Inv. № 0216RK01032.

18 Patent №14230 Respublika Kazakhstan, G01N 33/535. Sposob opredeleniya antitel protiv vozbuditelya brutselleza // Shenzhanov K.T., Suranshiyev ZH.A., Bulashev A.K, Ospanova S.G.;

zayavl. 22.07.2002; opubl. 15.04.2008., Byul.4. - 4 s.

19 Bradford M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding // Analytical Biochemistry. – 1976. – Vol.72. – P.248-254.

20 Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. – 1970. – Vol.227. – P.680-685.

21 Letesson J.J., Tibor A., van Eynde G., Wansard V., Weynants V., Denoel P. and Saman E.

Humoral immune responses of Brucella-infected cattle, sheep, and goats to eight purified recombinant Brucella proteins in an indirect enzymelinked immunosorbent assay // Clin. Diagn. Lab. Immunol. – 1997. – Vol.4. – P.556-564.

References