пшеницы, с применением вторых антител, конъюгированных с пероксидазой.
Следует отметить, что вирусный белок EEV119 является гидрофобным. Это подтверждается компьютерным анализом, а также тем обстоятельством, что этот белок локализуется во внешней плазматической мембране клетки-хозяина. Известно, что синтез гидрофобных белков в бесклеточной системе значительно затруднен, из-за отсутствия или деградации мембранных структур, а также систем сортинга белков. Несмотря на это обстоятельство, как вирусный, так и искусственный трансляционные энхансеры обеспечивают достаточно высокий уровень синтеза белка EEV119 в бесклеточной системе из зародышей пшеницы. Также был проведен анализ белковых продуктов in vitro-трансляции мРНК «Y-EEV119-TMV» и
«ARCх3 –EEV119-TMV» с использованием метода иммуноблотинга (вестерн-блотинга).
В качестве первых антител использовались специфические к вирусу оспы овец сыворотки мышей.
Результаты анализа приведены на рисунке 4.
Из-за того, что в качестве первых антител выступали не моноклональные, и даже не специфические поликлональные антитела к белку EEV119, на мембране проявлялись не только полосы, соответствующие исследуемому белку, но также и другие вирусные, а также некоторые мажорные клеточные белки. Однако, во второй и третьей дорожках (конструкции «ARCх3-EEV119-TMV» и «Y-EEV119-TMV»), присутствует полоса, соответствующая по электрофоретической подвижности белку EEV119 (около 23 кДа), которой не наблюдается на дорожке 4, соответствующей контрольной точке без добавления каких-либо мРНК.
Таким образом, в результате проведенных исследований определены антигенно активные белки вируса оспы овец. Осуществлено клонирование гена EEV119 данного вируса в плазмидные вектора с получением ДНК-конструкций «Y-EEV119-TMV» и «ARCx3-EEV119-TMV». По матрицам этих ДНК-конструкций синтезированы соответствующие им РНК-конструкции, позволяющие продуцировать in vitro рекомбинантный белок EEV119. Было показано, что данный белок может корректно синтезироваться в растительных системах.
Следующим этапом работы может стать создание трансгенных растений, содержащих рекомбинантный ген белка внешней оболочки EEV119 вируса оспы овец, которые можно будет использовать в качестве съедобных вакцин для иммунизации овец.
Литература
1 Ma J., Drake P., Christou P. The production of recombinant pharmaceutical proteins in plants // Nature Reviews (Genetics). –2003. –V. 4. –P. 794-805.
2 Ma J, Chikwamba R., Sparrow P., Fischer R., Mahoney R., Twyman R. Plant-derived pharmaceuticals – The road forward // Trends in Plant Science. -2005. –V. 10. –P. 580-585.
74
3 Daniell H., Streatfield S., Wycoff K. Medical molecular farming: production of antibodies, biopharmaceuticals and edible vaccines in plants // Trends in Plant Sci. –2001. –V. 6. –P. 219-226.
4 Hansen E. Production of recombinant antigens in plants for animal and human immunization-a review //
Braz.J.Genet. – 1997. - Vol.20, No.4. - P.1-15
5 Михайлов, В.В., Ручко, В.М., Махлай А.А. Трансгенные растения вакцинологии // Вопросы вирусологи.
–2001. -№1. -С.4-8.
6 Рукавцова Е.Б., Золова О.Э., Бурьянова Н.Я., Борисова В.Н., Быков В.А., Бурьянов Я.И. Анализ трансгенных растений табака, содержащих ген поверхностного антигена вируса гепатита В // Генетика. – 2003. –T.39, №1. -С. 51-56.
7 Филдс Б., Найп Д. Вирусология. - М.: Мир. -1989. -Т.1. -С. 26-28.
8 Gurevich. V., Pokrovskaya I.D., Obukhova T.A. Preparative in vitro mRNA synthesis using SP6 and T7 RNA polymerases // Anal.Biochem. -1991. -V.195. -P. 207-213.
9 Akbergenov R., Zhanybekova S., Kryldakov R., Zhigailov A, Polimbetova N., Hohn T., Iskakov B. ARC-1, a sequence element complementary to an internal 18S rRNA segment, enhances translation efficiency in plants when present in the leader or intercistronic region of mRNAs // Nucleic Acids Research. –2004. –V. 32. –P. 239-247.
10 Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature.
-1970. -V. 227. -P. 680-685.
11 Molecular cloning: A laboratory manual / E.F. Fritsch, T. Maniatis., Cold Spring Harbor Laboratory Press.
-2-d edition. -1989. -V. 3.
12 Tulman E.R., Afonso C.L., Lu Z., Zsak L., Sur J.-H., Sandybaev N.T., Kerembekova U.Z., Zaitsev V.L., Kutish G.F., Rock D.L. The genomes of Sheeppox and Goatpox Viruses. // Journal of Virology. –2002. -V. 76, No. 12. -P. 6054 – 6061.
13 B. N. Fields, D. M. Knipe, P. M. Howley, R. M. Chanock, J. L. Melnick, T. P. Monathy, B. Roizman, and S. E.
Straus (ed.), Fields virology, 4th ed. Lippincott, Williams and Wilkins, Philadelphia, Pa. –2001. -P. 2885–2921.
Тұжырым
Қой шешегі вирусының (SPPV, «НИСХИ» штамы) сыртқы қабықшасында орналасқан трансмембрандық белокты кодтайтын EEV119 кДНК-ген клондалды. «Y-EEV119-TMV» жəне «ARCх3-EEV119-ТМV»
рекомбинанттық конструкциялар жасалды. 5’-трансляцияланбайтын тізбек (5’-TT) ретінде картоп Ү-вирусының (PVY) геномдық (г)РНҚ-ның 5’-TT «Y-EEV119-TMV» конструкциясында болды, ал «ARCх3-EEV119-ТМV»
конструкциясында бидай 18S рРНҚ-ның орталық аумағына (1113-1122 нуклеотидтер) комплементарлы 10- нуклеотидтік үш көшірме (ARCх3) болды. Сəйкес мРНҚ-дары in vitro жағдайда түзіліп, олардың тең жартысы бидай ұрығынан алынған жасушасыз жүйеде трансляцияланды. Екі конструкция да SPPV EEV119 белогының түзілуін айтарлықтай деңгейде қамтамасыз етсе де, PVY гРНҚ 5'-ТТ белок түзілуін күшейтуде ең жоғары қабілетпен ерекшеленді.
Summary
The cDNA gene, coding sheeppox virus (SPPV) (“NISCHI” strain) external envelope protein EEV122 has been cloned. Recombinant DNA-constructions «Y-EEV119-TMV» and «ARCх3-EEV119-ТМV have been constructed. The first recombinant construction «Y-EEV119-TMV» in its 5’-untranslated region (5’-UTR) contained 5’-UTR of Potato Virus Y (PVY) genomic RNA, and the second one «ARCх3-EEV119-ТМV» in its 5’-UTR contained three copy of 10- nucleotide sequence “ARC” (“ARCx3”), which was complementary to the central region of wheat 18S rRNA (nucleotides 1113-1122). Correspondent mRNAs have been synthesized in vitro, and these mRNAs were translated in wheat germ cell free system. It was shown, that both RNA-constructions provided a high level of SPPV EEV119 protein synthesis, though 5’-UTR of PVY gRNA provided higher translation level, than “ARCx3” sequence.
УДК 575.633.11
Чунетова Ж.Ж.
РОЛЬ СОРТА В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ МУТАГЕНЕЗЕ (Казахский национальный университет им. аль-Фараби)
Проведен моносомный анализ реакции сорта Казахстанская 126 на действие ПАВ по фазам развития и по ряду количественных признаков. Выявлено различие между эффектом моносомного состояния растений и реакцией этого состояния на действие ПАВу сорта Казахстанская 126. Под действием ПАВустановлено, что в хромосомах 7А и 1В локализованы гены, контролирующие раннее появление всходов, в хромосомах 2А, 6А – ускорение кущения, а в хромосомах 3А и 6D локализованы гены, определяющие замедление кущения. В процессе изучения мейоза молодых колосьев сорта Казахстанская 126 в опытном варианте наблюдалось нерасхождение хромосом (пикноз), такое нарушение обычно несвойственно моносомным линиям. Гены, контролирующие пикноз были локализованы в 1В, 2D и 3D хромосомах.
Работами ряда исследователей (Ларченко Е.А., Моргун В.В. и др.) убедительно показано, что с помощью мутагенов можно изменить такие признаки, как урожайность, высота стебля и плотность колоса, окраска и
75
качество зерна, устойчивость к болезням и т.д., сохранив в то же время основную совокупность свойств исходного сорта. Химический мутагенез используется в селекционной работе для увеличения разнообразия, идентификации формообразовательного процесса и получения селекционно-значимых отклонений у пшеницы.
Известно, что мутагены неодинаково воздействуют на отдельные генотипы пшеницы. Получение мутантных форм и их изучение - это только первый этап селекционной работы. Более важным является использование мутантов в гибридизации с целью получения положительных трансгрессий. Однако, получение мутантов и использование их для гибридизации требуют изучения генетической природы возникающих изменений, что имеет огромное значение для подбора эффективных и специфически действующих мутагенов.
Мутанты обладающие комплексом морфологических, физиологических и биохимических изменений, затрагивающих хозяйственно-ценные свойства в дальнейшем могут быть использованы для локализации генов, определяющих данный признак с последующим межсортовым замещением хромосом.
Кроме того, одним из способов ускорения размножения ценных линий пшеницы, полученных путем мутагенеза является применение новых биорегуляторов на основе фитогормонов. Фитогормонам принадлежит важная роль в регуляции жизни растений. Их функция проявляется на всех этапах онтогенеза растений.
Под влиянием удобрений и биологически активных веществ были получены определенные стойкие наследственные изменения, что позволяет поставить перед исследователями задачу поиска факторов и воздействий вызывающих определенный спектр изменений как типа модификаций, так и наследственных изменений. Во многих работах обнаружена индивидуальная реакция различных сортов пшеницы на одни и те же химические вещества, что свидетельствует о роли генотипа сорта в ответной реакции на воздействие и о существовании генетического контроля этой реакции. Изучение действия ПАВ (поверхностно-активное вещество) может оказаться полезным в плане этой перспективы. Экологические работы по изучению воздействия антропогенного фактора, приводящего к нарушению определенных соотношений между химическими элементами и их соединениями, возрастанию концентрации тяжелых металлов в почве делает актуальным исследование мутагенного и токсического эффекта форм тяжелых металлов. Выбор факторов, действие которых будет изучено, обусловлен все большим распространением солей тяжелых металлов в природе и литературными сведениями о их мутагенном и токсическом действии. Таким образом, их использование дает возможность, с одной стороны расширить наследственную изменчивость и провести селекционную оценку материала, с другой – изучить специфичность реакции на действие мутагенов на сортовом и на хромосомном уровнях. Зависимость специфичности реакции на действие солей тяжелых металлов, ПАВ будут изучаться с помощью анеуплоидных линий.
Материалы и методы
Материалом для проведения опытов служили серия 21 моносомной линии сорта Казахстанская 126.
Контрольным вариантом были моносомные линии Казахстанская 126, а опытным вариантом - те же моносомные линии, но обработанные ПАВ.
Изучение реакции пшеницы на действие CdCl2, ZnCl2, биологически активных соединений ПАВ и цитокинина проводили на полях Республиканского научно-производственного Центра “Земледелие и растениеводство”. Посевной материал высевали в рядки шириной в 1 метр по 20 зерен, а анеуплоидные линии по 15 зерен в каждом ряду. Расстояние между рядками 15 см. Для изучения мейоза молодые колосья с каждого растения фиксировали в утренние часы с 6 до 9 часов. Фиксацию проводили в фиксаторе Кларка. Материал хранился в 70% спирте в холодильнике. В качестве красителя использовали 2% раствор ацетокармина, при- готовленный на 45% растворе уксусной кислоты. Идентификацию моносомных и дисомных растений проводили путем цитологического анализа. Цитологические исследования проводили на временных давленных препаратах с помощью микроскопа МБИ-3. Моносомные растения идентифицировали по наличию унивалента в метафазе первого деления мейоза и на основании подсчета числа хромосом в анафазе первого деления материнских клеток пыльцы.
Фенотипический спектр изменений у сортов, вызванный действием CdCl2, ПАВ и цитокинина
Изучение влияния химического соединения CdCl2, биологически активных веществ ПАВ и цитокинина на районированные сорта яровой мягкой пшеницы (Шагала, Толкын, Дауыл, Казахстанская 3, Казахстанская 4, Казахстанская 17, Женис, Лютесценс 32) проводили в полевых условиях. В результате исследования выяснено, что биологически активные химические соединения индуцируют у пшеницы эпигенетические изменения, выражающиеся в стимуляции прорастания, ускорение роста первичных корней и последующее увеличение продуктивности колоса по сравнению с контрольными вариантами, а также приводят к морфологическим изменениям растений - скверхедный и спельтоидный тип колоса, удлинение колоса, ветвление колоса, удлинение члеников стержня колоса, толстая соломина, коленчатый тип стебля, утолщение и удлинение стеблевых узлов, повышенная кустистость (14-16) по сравнению с контролем (3-4), рыхлые удлиненные колосья, многоцветковые и плотные колосья, компактоидные колосья, а также растения с ломкими колосьями и тонкой соломиной. Кроме того, у отдельных сортов опытного варианта были отмечены ослабленные растения и широкий диапазон изменчивости по высоте растений.
Реакция моносомных растений сорта Казахстанская 126 надействие поверхностно-активных веществ Второе направление работы - изучение реакции моносомных растений на действие поверхностно- активных веществ (ПАВ). В качестве модельного объекта для исследования был взят сорт Казахстанская 126 и серия моносомных линий по этому сорту. Проводили фенологические наблюдения начиная с даты появления всходов до восковой спелости.
76
В результате наблюдения за ростом и развитием моносомных растений обнаружено различие между мо- носомными растениями по определенным хромосомам опытного варианта и контроля по появлению всходов, кущения, трубкования, колошения и восковой спелости (таблица 2).
Таблица 2 - Реакция роста и развития моносомных растений на действие поверхностно - активных веществ