Своевременная диагностика — залог успешного проведения профилактических мероприятий по устра- нению тех или иных болезней. Для быстрой детекции и точной идентификации возбудителя вызываю- щего пятнистость листьев пшеницы необходима разработка высокочувствительного и скоростного ме- тода анализа. В данных исследованиях проведены работы по разработке высокоспецифичного метода ПЦР для диагностики фитопатогенного гриба Zymoseptoria tritici. В результате исследований были ото- браны нуклеотидные последовательности для Zymoseptoria tritici из базы данных GenBank. Используя данные последовательности, были сконструированы и синтезированы специфические праймеры. Про- ведены работы по отработке оптимальных условий проведения ПЦР по таким параметрам, как концен- трации ДНК полимеразы, ионов Mg2+ и дНТФ. Также осуществлены работы по определению чувстви- тельности и специфичности разработанного метода ПЦР. Чувствительность данного метода составила 0,69 пг ДНК патогена в исследуемом материале. В результате исследований специфичности установ- лено, что разработанный метод не выявил ДНК гетерологичных грибов. Таким образом, разработанный метод диагностики на основе ПЦР для выявления гриба Zymoseptoria tritici показал высокую специфич- ность и чувствительность который в дальнейшем может использоваться в качестве диагностического набора на основе ПЦР для выявления гриба Zymoseptoria tritici.
Ключевые слова: Zymoseptoria tritici, фитопатогенный гриб, диагностика, специфичность, чувствитель- ность.
Введение
Мировые эксперты в области продовольствия утверждают, что самым важным показателем наци- ональной безопасности страны является производство зерна пшеницы. По данным международной продовольственной и сельскохозяйственной организаций, огромные потери урожая пшеницы проис- ходят от вредителей на 34 %, а от болезней на — 12 % [1]. Десятилетиями Казахстан производит зерно, которое покрывает не только внутренний рынок страны, но и рынок республик Средней Азии. Являясь одним из крупных производителей зерна республика ежегодно теряет более 30 % от общего количества урожая [2; 38, 3]. Одной из причин этому являются грибковые болезни пшеницы, среди которых нема- ловажную роль в причинении урона урожаю отводится Z. tritici.
Z. tritici является разновидностью мицелиального гриба, аскомицета из семейства Mycosphae- rellaceae. Данный возбудитель поражает только листья и проявляется на ранней стадии развития рас- тения. Патоген вызывает пятнистость листьев, которую трудно контролировать из-за устойчивости к множественным фунгицидам [4]. Контроль над Z. tritici был основан на комбинации применения фун- гицидов и селекции устойчивых сортов [5, 6]. Повышение уровня нечувствительности к системным фунгицидам и принятие политики по сокращению пестицидов в соответствии с европейским законо- дательством [7] означают, что сейчас существует большая потребность в разработке современных ди- агностических средств, для своевременного выявления ДНК гриба Z. tritici. Сегодня для диагностики гриба Z. tritici наряду с морфологическими исследованиями широко используют молекулярно-биоло- гические и иммунологические методы. Однако недостатки данных методов, обусловленные низкой чувствительностью, трудоемкостью проведения работы, и затраты длительного времени создают необ- ходимость разработки более чувствительного и быстрого метода детекции.
Молекулярно-биологические и генно-инженерные достижения последнего десятилетия создают возможность разработки различных методов для специфической диагностики фитопатогенных микро- организмов. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) по сравнению с традиционными иммуноло- гическими методами более чувствителен и специфичен. ПЦР широко используется в целях дифферен- циации и своевременном обнаружении возбудителей различных заболеваний. Для диагностики возбу- дителей видов септориоза были разработаны многочисленные методы молекулярной идентификации
Э.Т. Тайлакова, А.У. Исабек и др.
грибов на основе ПЦР [8–12]. Недостатки данных методов, обусловленные ограниченной специфич- ностью, необходимостью создания стандартной кривой при каждой постановке реакции, а также труд- ности, связанные с контаминацией смеси при постановке реакции в режиме реального времени, со- здают необходимость разработки классического метода анализа обладающей высокой специфично- стью. Исходя из изложенного выше, целью данной работы является разработка метода ПЦР для диа- гностики фитопатогенного гриба Z. tritici.
Материалы и методы исследования
Подбор и синтез праймеров. Подбор праймеров осуществляли с использованием GenBank NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank) и программного обеспечения CLC GenomicsWorkbench 11.0.1 (Qiagen). Специфичность олигонуклеотидных праймеров проверяли в программе BLAST. Синтез оли- гонуклеотидных праймеров проводили на автоматическом синтезаторе фирмы K&A Laborgeraete, мо- дели DNA/RNA Synthesizer H-16 (производство Германии), амидофосфитным методом согласно ин- струкции производителя.
Выделение и выращивание возбудителя септориоза. Выделение и выращивание чистой культуры проводили по стандартной методике [13].
Выделение ДНК грибов. Выделение ДНК проводили как из чистой культуры, так и из образцов пораженных листьев. К 100 мкл пробы добавляли 700 мкл буфера СТАВ предварительно разогретого до 65 ºС (после нагревания в буфер добавляли β-меркаптоэтанол 400 мкл на 20 мл буфера). И тща- тельно перемешивали. Далее заливали такой же объем хлороформа и тщательно вортексировали. Цен- трифугировали в течение 5 мин при 13000 об/мин, супернатант переносили в новые 1,5 пробирки. По- вторяли этап экстракции хлороформом. К супернатанту добавляли 2/3 объема изопрапанола, вортек- сировали и центрифугировали в течение 5 мин при 13000 об/мин. Надосадок аккуратно сливали и про- водили промывку осадка 75 % спиртом. Центрифугировали в течение 60 с при 13000 об/мин, надосадки аккуратно сливали и осадки подсушивали при комнатной температуре с открытой крышкой. Осадок растворяли в 50 мкл стерильной дистиллированной воде [14].
ПЦР-амплификация. ПЦР-реакция проводилась с использованием амплификаторов Master- cyclerРroS (Eppendorf, Германия) и SimpliAmpThermalCycler (AppliedBiosystems, США). В реакцион- ную смесь использовали 10× ПЦР буфер (Sileks, Москва, Россия), 10 мМдНТФ (Invitrogen, США), 25 мМ MgCl2 (Sileks, Москва, Россия), Taq полимераза (Sileks, Москва, Россия).
Анализ результатов. Разделение продуктов амплификации проводили с использованием электро- фореза в 1 % агарозном геле, содержащем 1 мкг/мл бромистого этидия в трис-ацетатном буфере. Для детекции результатов ПЦР использовали трансиллюминатор BioRad.
Секвенирование ДНК грибов. Секвенирование фрагментов амплификации выполняли с помощью набора BigDyeTerminatorCycleSequencingkit v 3.1 («AppliedBiosystems», США), согласно инструкции изготовителя, на 3130xl GeneticAnalyzer («AppliedBiosystems», США). Сборку и анализ полученных в результате секвенирования последовательностей проводили с использованием программы Sequencher v. 5.4.1.
Результаты исследований и их обсуждение
В наших исследованиях по подбору специфических праймеров мы остановились на участках внут- ренних транскрибированных спейсерах (ITS1-ITS2). Два ITS регионы часто используют для диффе- ренциации грибов на уровне родов и видов. Эти участки генома грибов окружают последовательность, кодирующую 5.8S рРНК, и расположены между генами, кодирующими 18S рРНК (малая субъеди- ница — SSU) и 28S рРНК (большая субъединица — LSU). Регион ITS очень стабилен, присутствует в нескольких повторностях и обычно консервативен внутри вида [15]. Для подбора праймеров был про- веден поиск нуклеотидных последовательностей ITS в международной базе данных GenBank. Были отобраны последовательности для гриба Z. tritici. Выравнивание нуклеотидных последовательностей и подбор специфических праймеров проводили с использованием программы CLC Genomics Workbench v.11.0.1. Подобранные праймеры были проверены на специфичность с использованием про- граммы BLAST. Для дальнейших работ были выбраны праймеры, показывающие 100 % специфич- ность с соответствующим возбудителем. Таким образом, была подобрана пара специфических прай- меров — ZT191F и ZT444R, амплифицирующие участок длиной 254 п.н., характерный только для Z. tritici.
Разработка метода полимеразной цепной реакции …
Подобранные праймеры были синтезированы на синтезаторе олигонуклеотидов фирмы K&A Laborgeraete. Представленные характеристики праймеров полностью соответствуют требуемым пара- метрам олигонуклеотидов, используемых для постановки ПЦР.
Важным этапом при начальной отработке ПЦР является наличие специфичной ДНК. С целью по- лучения качественной и специфичной ДНК проводили наработку моноконидиальных культур грибов.
Чистоту культуры подтверждали микроскопическим методом. Из полученной культуры выделяли ДНК и определяли его видовую идентичность с помощью секвенирования. Для этого проводили нара- ботку ПЦР-продукта с использованием универсальных праймеров на ITS регион (ITS-4 — TCCTCCGCTTATTGATATGC и ITS-5- GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG) [16]. Полученный ПЦР- продукт секвенировали на 16-капиллярном секвенаторе 3130xl GeneticAnalyzer. Полученные в ходе се- квенирования нуклеотидные последовательности сравнивали с помощью программы BLAST с после- довательностями, размещёнными в международном банке генов GenBank. Результаты сравнительного анализа представлены на рисунке 1.
Рисунок 1. Сравнительный анализ ДНК, выделенной из Z. tritici
Таким образом, было получено 100 %-ное подтверждение чистоты имеющихся культур, что необ- ходимо для оптимизации всех параметров ПЦР.
Для получения специфической и эффективной амплификации проводили работы по определению оптимальной концентрации каждого реагента входящего в состав смеси. Оптимизированы были такие реагенты, как Taq ДНК полимераза, концентрации дНТФ, праймеров и ионов Mg2+. При амплификации использовали следующие параметры: начальная ПЦР-активация при 94 ºС — 3 мин, денатурация при 94 ºС — 30 с, отжиг при 60 ºС — 30 с, элонгация при 68 ºС — 1 мин 20 с, финальная элонгация при 68 ºС — 5 мин, амплификацию ПЦР осуществляли в течение 35 циклов.
Активность ДНК полимеразы является одним из наиболее важным при проведении оптимизации ПЦР. Концентрация полимеразы подбирается в зависимости от праймеров или мишени НК. При высокой концентрации может наработаться неспецифический продукт, при более низкой нарабатывается недо- статочное количество амплификата. Обычно рекомендуется использовать ДНК полимеразу в конечной концентрации 0,5–2,5 ед. на 50 мкл реакционной смеси. Для отработки оптимальной концентрации ДНК полимеразы нами был выбран диапазон от 0,5 до 4 ед. Состав реакционной смеси содержал 0,2 мM дНТФ, 2 мM Mg2+ и 400 нM каждого праймера. Результаты представлены на рисунке 2.
М — маркер ДНК; 1 — 4 ед.; 2 — 3,5 ед.; 3 — 3 ед.; 4 — 2,5 ед.; 5 — 2 ед.; 6 — 1,5 ед.; 7 — 1 ед.; 8 — 0,5 ед.
Рисунок 2. Оптимизация Taq ДНК полимеразы в реакционной смеси при обнаружении ДНК Z. tritici методом ПЦР
Э.Т. Тайлакова, А.У. Исабек и др.
Как видно из рисунка 1, концентрация Taq ДНК-полимеразы влияет на выход конечного продукта.
Видно, что с повышением концентрации фермента в реакционной смеси происходит увеличение ин- тенсивности полос, а, следовательно, и концентрации ДНК. Однако при активности фермента всего 0,5 ед. нарабатывается ПЦР-продукт, который достаточно легко визуализировать в 1 %-ном агарозном геле в присутствии бромистого этидия под УФ-светом. Для дальнейшей отработки метода была вы- брана концентрация 1 ед. Taq ДНК полимеразы.
При постановке ПЦР немаловажную роль играет и концентрация Mg2+ в реакционной смеси. Ионы Mg2+ взаимодействуют с другими компонентами реакционной смеси, формируют комплексы с дНТФ и стабилизируют двухцепочечную ДНК. Концентрация Mg2+ также влияет на отжиг праймеров и дена- турацию образца. Однако его избыток может вызывать образование неспецифических продуктов, а не- достаток может приводить к низкой эффективности амплификации. Рекомендуемая концентрация Mg2+ составляет 1–4 мМ, однако оптимальная концентрация должна быть определена эксперимен- тально. В экспериментах мы испытывали концентраций Mg2+ от 0,5 до 6 мМ (рис. 3). Реакционная смесь содержала 1 ед. ДНК полимеразы, 0,2 мМдНТФ и 400 нМ каждого праймера.
М — маркер ДНК; 1 — 6 мМ; 2 — 4 мМ; 3 — 3 мМ;
4 — 2,5 мМ; 5 — 2 мМ; 6 — 1,5 мМ; 7 — 1 мМ; 8 — 0,5 мМ Рисунок 3. Оптимизация концентрации Mg2+ в реакционной смеси
при обнаружении ДНК Z. tritici методом ПЦР
Как видно из данных на рисунке 3, амплификация специфичного продукта наблюдается при кон- центрациях от 2 до 6 мМ, однако при концентрации Mg2+ выше 2,5 мМ наблюдается появление неспе- цифических продуктов реакции. В результате для дальнейших экспериментов использовали ионы Mg2+
в концентрации 2 мМ.
Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (дНТФ) служат субстратами для процесса элонгации. Также дНТФ уменьшает количество свободных ионов Mg2+, что, в свою очередь, влияет на активность фер- мента и температуру отжига праймеров. Оптимальная концентрация дНТФ обычно составляет 0,2 мМ.
Для оптимизации данного параметра мы испытывали концентрации дНТФ в пределах от 0,01 до 1 мМ (рис. 4). Реакционная смесь содержала 1 ед. ДНК полимеразы, 2 мМ Mg2+ и 400 нМ каждого праймера.
М — маркер ДНК; 1 — 0,01 мМ; 2 — 0,05 мМ; 3 — 0,1 мМ; 4 — 0,2 мМ; 5 — 0,5 мМ; 6 — 1 мМ Рисунок 4. Оптимизация концентрации дНТФ в реакционной смеси
при обнаружении ДНК Z. tritici методом ПЦР
Разработка метода полимеразной цепной реакции …
Как видно из рисунка 4, наработка ПЦР-продукта прекращается при использовании концентрации дНТФ от 0,5 мМ и выше. Для проведения дальнейших исследований была выбрана оптимальная кон- центрация дНТФ — 0,2 мМ.
В результате оптимизации компонентного состава были определены следующие оптимальные концентрации реакционной смеси — 1 ед. ДНК полимеразы, 0,2 мМ дНТФ, 2 мМ Mg2+ и по 400 нМ каждого праймера.
Основными факторами, определяющими преимущества одного метода диагностики над другим, являются чувствительность и специфичность. Известно, что достоинством ПЦР является чрезвычайно высокая чувствительность этого молекулярно-биологического исследования. Далее, используя опти- мальный состав реакционной смеси, определяли чувствительность разрабатываемого метода ПЦР. При определении чувствительности разработанной ПЦР использовали 10-кратные разведения ДНК от 69 нг до 0,069 фг. Результаты данных опытов представлены на рисунке 5.
М — маркер ДНК; 1 — 6,9 нг; 2 — 0,69 нг; 3 — 69 пг; 4 — 6,9 пг; 5 — 0,69 пг; 6 — 0,069 пг; 7 — 69 фг;
8 — 6,9 фг; 9 — 0,69 фг; 10 — 0,069 фг; ок — отрицательный контроль; пк — положительный контроль Рисунок 5. Определение чувствительности ПЦР при обнаружении ДНК Z. tritici
Чувствительность данного метода ПЦР составила 0,69 пг ДНК Z. tritici в пробе (рис. 5). Данные результаты показали, что отработанный метод ПЦР обладает высокой чувствительностью.
Специфичность метода ПЦР многократно превосходит любые другие используемые методы диа- гностики, в том числе ИФА. Далее проводили определение специфичности разработанного метода ПЦР. Для идентификации гриба Z. tritici использовали ДНК гриба Z. tritici и ДНК гетерологичных гри- бов Pyrenophoratritici-repentis, Parastagonosporanodorum, AlternariaInfectoria, AlternariaAlternata, Fusarium, Epicoccum, Ascomycota, Leconicillium, Stemphylium, подтвержденные секвенированием, а в качестве положительного контроля ДНК Z. tritici ITC и отрицательного контроля — воду. Результаты проведенных исследований представлены на рисунке 6.
М — маркер ДНК; 1 — ДНК Pyrenophora tritici-repentis; 2 — ДНК Z. tritici;
3 — ДНК Parastagonospora nodorum; 4 — ДНК Alternaria Infectoria; 5 — ДНК Alternaria Alternata;
6 — ДНК Alternaria; 7 — ДНК Fusarium-1; 8 — ДНК Fusarium-4; 9 — ДНК Epicoccum-21;
10 — ДНК Epicoccum-28; 11 — ДНК Ascomycota; 12 — ДНК Leconicillium; 13 — ДНК Stemphylium;
пк — положительный контроль, ДНК Zymoseptoria tritici ITC; ок — отрицательный контроль, вода Рисунок 6. Определение специфичности ПЦР при обнаружении ДНК Z. tritici
Как видно из рисунка 6 только в пробах, содержащих ДНК гриба Z. tritici, нарабатываются специ- фические продукты реакции размером около 254 п.н. (дорожки 1 и пк). Отрицательные результаты
Э.Т. Тайлакова, А.У. Исабек и др.
были получены при использовании в качестве матриц ДНК остальных гетерологичных грибов, кроме ДНК Epicoccum-28 (дорожка 10). Однако данный продукт нарабатывается более тяжелым размером, тем самым эта ДНК не является специфическим продуктом для данной реакции. Отсутствие каких- либо продуктов амплификации наблюдается и с деионизированной водой. Полученные результаты де- монстрируют высокую специфичность разработанного нами способа диагностики ДНК гриба Z. tritici.
Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что во всех пробах, содер- жащих ДНК гриба Z. tritici, нарабатывался специфический ПЦР-продукт, соответствующий расчет- ному размеру.
Заключение
В результате проведенных исследований при разработке ПЦР для диагностики фитопатогенного гриба Z. tritici были подобраны видоспецифические праймеры, отработаны оптимальные параметры для постановки реакции. Разработанный способ диагностики на основе ПЦР для выявления гриба Z.
tritici показал высокую специфичность и чувствительность (0,69 пг ДНК).
Исследования выполнены при поддержке Министерства сельского хозяйства Республики Казах- стан в рамках ПЦФ «Разработка инновационных систем для повышения устойчивости сортов пше- ницы к особо опасным болезням в Республике Казахстан» на 2018–2020 гг. (№ BR06249329).
Список литературы
1 FAO statistical yearbook. World food in agriculture. — Rome. — 2013. — P. 289.
2 Койшыбаев М. Болезни зерновых культур / М. Койшыбаев. — Алматы: Бастау, 2002. — С. 38–40.
3 Рсалиев Ш.С. Анализ состава популяций стеблевой и листовой ржавчины пшеницы на территории Казахстана / М.К. Койшибаев, А.И. Моргунов, Д. Колмер // Материалы междунар. науч.-практ. конф. — Алматы, 2005. — С. 267–272.
4 Stukenbrock E.H. Whole-Genome and Chromosome Evolution Associated with Host Adaptation and Speciation of the Wheat Pathogen Mycosphaerella graminicola / E.H. Stukenbrock, F.G. Jørgensen, M. Zala, T.T. Hansen, B.A. McDonald, M.H. Schierup //
PLoS Genetics. — 2010. — No. 6. — С. 12.
5 Orton E.S. Mycosphaerella graminicola: from genomics to disease control / E.S. Orton, S. Deller, J.K.M. Brown // Molecular Plant Pathology. — 2011. — No. 12. — Р. 413–424.
6 Torriani S.F.F. Zymoseptoriatritici: a major threat to wheat production, integrated approaches to control / S.F.F. Torriani, J.P.E. Melichar, C. Mills, N. Pain, H. Sierotzki, M. Courbot // Fungal Genetics and Biology. — 2015. — No. 79. — Р. 8–12.
7 Jess S. European Union policy on pesticides: implications for agriculture in Ireland / S. Jess, S. Kildea, A. Moody, G. Rennick, A.K. Murchie, L.R. Cooke // Pest Management Science. — 2014. — No. 70. — Р. 1646–1654.
8 Beck J.J. Polymerase chain reaction assays for the detection of Stagonospora nodorum and Septoriatritici in wheat / J.J. Beck, J.M. Ligon // Phytopathology. — 1995. — Vol. 85. — Р. 319–324.
9 Fraaije B.A. Rapid detection and diagnosis of Septoriatritici epidemics in wheat using a polymerase chain reaction / PicoGreen assay / B.A. Fraaije, D.J. Lovell, E.A. Rohel, D.W. Hollomon // Journal of Applied Microbiology. — 1999. — Vol. 86. — Р. 701–
708.
10 Абрамова С.Л. Диагностика фитопатогенных грибов Septoriatritici и Stagonospora nodorum методом FLASH ПЦР / С.Л. Абрамова, Д.Ю. Рязанцев, Т.М. Воинова, С.К. Завриев // Биоорганическая химия. — 2008. — № 34. — С. 107–113.
11 Abd-Elsalam K. Detection of Mycosphaerella graminicola in Wheat Leaves by a Microsatellite Dinucleotide Specific-Primer / K. Abd-Elsalam, A.H. Bahkali, M. Moslem, P.J. De Wit, J.A. Verreet// International Journal Molecular Science. — 2011. — Vol. 12.
— Р. 682–693.
12 Consolo V.F. A conventional PCR technique to detect Septoriatritici in wheat seeds / V.F. Consolo, C.M. Albani, C.M. Beron, G.L. Salerno, C.A. Cordo // Australasian Plant Pathology. — 2009. — Vol. 38. — Р. 222–227.
13 Bilay V.I. Methods of experimental mycology / V.I. Bilay. — Kiev: Naukova Dumka, 1973. — Р. 30–187.
14 Edwards S.G. PCR-based detection and quantification of mycotoxigenic fungi / S.G. Edwards, J.O’Callaghan, A.D.W. Dobson // Mycology Res. — 2002. — Vol. 106. — Р. 1005–1025.
15 Hughes K.W. Using heterozygosity to estimate a percentage DNA sequence similarity for environmental species’ delimitation across basidiomycete fungi / K.W. Hughes, R.H. Petersen, E.B. Lickey // New Phytology. — 2009. — Vol. 182. — Р. 795–798.
16 White T.J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics: PCR Protocols: a Guide to Methods and Applications / T.J. White, T. Bruns, S. Lee, J. Tailor. New York: Academic Press Inc, 1990. — Р. 315–322.
Разработка метода полимеразной цепной реакции …
Э.Т. Тайлакова, А.У. Исабек, Н.С. Кожабергенов, Н.Н. Мухами, В.М. Строчков, К.Т. Султанкулова, А.С. Рсалиев
Zymoseptoria tritici фитопатогенді зеңді бағалау үшін полимеразды тізбекті реакция әдісін жасақтау
Дер кезінде жүргізілген бағалау — белгілі бір ауруларды жою шараларының жақсы өтуінің кепілі. Би- дай жапырағының теңбіл дақтары қоздырғышын тез арада анықтау және дәл сәйкестендіру үшін жо- ғары сезімталды және жылдам жүргізілетін талдау әдісін жасақтау қажет. Осы зерттеулерде Zymoseptoria tritici фитопатогенді зеңді бағалау үшін полимеразды тізбекті реакция әдісін жасақтау мақсатында жұмыстар жүзеге асырылды. Жүргізілген жұмыстар нәтижесінде GenBank деректер база- сынан Zymoseptoria tritici арналған нуклеотидті қатар тізбегі таңдалынып алынды. Осы тізбектерді қол- дана отыра, телімді праймерлер құрастырылып синтезделінді. ПТР жүргізуді ДНК полимераза, Mg2+
иондары және дНТФ концентрациялары параметрлері бойынша оңтайландыру жұмыстары жүзеге асы- рылды. Сонымен қатар жасақталған ПТР әдісінің телімділігі мен сезімталдығы анықталды. Жасақтал- ған әдіс зерттелінген материалдан 0,69 пг мөлшерінде патогеннің ДНҚ сезімталды түрде анықтауға мүмкіндік беретіні анықталды. Телімділікті анықтау нәтижесінде жасақталған әдістің гетерологиялық саңырауқұлақтардың ДНҚ мен жұмыс істемейтіні белғілі болды. Нәтижесінде ПТР негізінде Zymoseptoria tritici саңырауқұлақты анықтауға жасақталған диагностика әдісі жоғары сезімталдылық пен телімділікті көрсетті. Жасақталған әдісті Zymoseptoria tritici зеңді белгілеуге арналған ПТР негі- зінде диагностикалық жиынтық ретінде қолдануға болады.
Кілт сөздер: Zymoseptoria tritici, фитопатогенді зең, диагностика, телімділік, сезімталдық.
E.T. Tailakova, A.U. Isabek, N.S. Kozhabergenov,
N.N. Mukhami, V.M. Strochkov, K.T. Sultankulova, A.S. Rsaliyev