Ген Длина гена,н.
Длина 5'UTR,н
Длина CDS,н.
Длина 3'UTR,н
miRNA на ген
Сайты/
ген
Сайты/
5'UTR
Сайты/
CDS
Сайты/
3'UTR
AKT2 5263 262 1446 3555 66 14,6 7,7 5,5 18,9
ANTXR1 5893 356 1695 3842 27 4,6 11,3 9,5 1,8
ATF2 2111 262 1518 331 4 1,9 3,8 2,0 0,0
BCAS1 3475 338 1755 1382 19 5,5 11,9 4,7 5,1
BID 2490 324 726 1440 12 5,2 9,3 6,9 3,5
BIRC6 15703 134 14574 995 47 3,1 15,0 3,2 0,0
DMD 13993 244 11058 2691 24 2,1 4,1 2,3 1,1
DNMT3A 4380 338 2739 1303 30 7,5 11,9 9,1 3,1
DTL 4412 314 2193 1905 8 1,8 6,4 1,8 1,1
EBF3 4361 59 1656 2646 21 5,0 17,2 5,4 4,5
ERBB4 11923 98 3927 7898 27 2,4 10,3 3,3 1,8
HUWE1 14735 402 13125 1207 55 4,3 10,0 4,4 2,5
IGF2 5165 752 543 3870 58 13,8 14,7 1,9 15,3
LFNG 2374 17 1140 1217 30 13,9 0,0 12,3 15,6
MAP2K4 3743 69 1200 2474 14 4,0 14,5 8,3 1,6
MCM7 2900 1117 1632 151 28 9,7 13,4 7,4 6,6
MTUS1 6419 474 3813 2132 13 2,0 4,2 2,1 1,4
NR2F2 5110 1224 1245 2641 33 8,4 7,4 12,1 7,2
PTK2 4453 230 3159 1064 13 2,9 17,4 2,9 0,0
SDCCAG8 2604 156 2142 306 12 4,6 12,8 3,3 9,8
SPATA13 8457 322 3834 4301 48 6,3 18,6 8,1 3,7
Ср.знач. 6380 357 3577 2255 28 5,5 11,1 5,2 4,4
40
Наибольшая плотность сайтов взаимодействия miRNA с mRNA характерна для 5'UTR. Если исходить из биологической роли miRNA как регуляторов трансляции, то предпочтительнее это делать на 5'UTR, поскольку быстрее и энергетически выгоднее блокировать трансляцию в самом начале процесса без связывания с рибосомой.
Связывание miRNA с CDS предполагает прекращение элонгации белка при достижении соответствующего сайта их взаимодействия. При связывании miRNA с 3'UTR белок может синтезироваться полностью, либо блокироваться на последних этапах элонгации, если комплекс RISC (RNA-induced silencing complex) будет этому препятствовать.
Рассмотренные выше отличия взаимодействия miRNA с mRNA различных генов свидетельствует о неслучайном выборе определенных участков mRNA для взаимодействия с miRNA. Можно предположить, что mRNA этих генов в процессе эволюции обрели такую 3D-конформацию, которая позволяет 5'UTR, CDS и 3'UTR взаимодействовать с соответствующими miRNA. Некоторые in-miRNA имеют предпочтение связываться с 5'UTR относительно других областей mRNA. Например, miR-1268b связывается с 5'UTR mRNA одиннадцати генов, miR-4486 - семи, miR-1228* - шести, а miR-1908, miR-3173, miR-3178 и miR-4258 - пяти генов.
Некоторые mRNA имеют участки с высокой плотностью связывания miRNA. Например, в 3'UTR mRNA гена ААКТ в участке с началом 3089-3095 н. расположено 8 сайтов, в 5'UTR mRNA гена МСМ2 с началом 245- 262 н. - 7 сайтов, а 5'UTR mRNA гена НDАС4 имеется 4 участка для связывания по 4-7 miRNA. miRNA отличаются по количеству сайтов связывания с mRNA разных генов. Из in-miRNA с mRNA 51 гена наибольшее количество сайтов имеет miR-1268b - 45 сайтов. Эти сайты находятся в mRNA 19 генов, причем в mRNA генов AATK, HDACY и NOTCH1 расположено по 5 сайтов. MiR-4308 и miR-4486 имеют по 26 сайтов соответственно в mRNA 21 и 18 генов. Подавляющее число miRNA имеют по одному сайту связывания с mRNA одного гена.
Многие in-miRNA, связываются в некоторых mRNA с несколькими сайтами. Например, с CDS mRNA гена NOTCH1 связываются в пяти сайтах miR-1268, miR-3665, miR-4266, miR-4455 и miR-4472. С 5'UTR mRNA гена HDAC4 связываются в пяти сайтах miR-1268, miR-4443, miR-4466, miR-4483 и в шести сайтах miR-4674.
miR-4508 имеет 32 сайта связывания в 18 генах и из этих сайтов 15 расположены в 5'UTR, что явно не случайно. Количество сайтов связывания miRNA с mRNA говорит о силе контроля экспрессии гена со стороны соответствующей miRNA, а количество генов контролируемых конкретной miRNA свидетельствует о функциональной важности этой miRNA.
Анализ результатов действия 51 in-miRNA на mRNA кодирующих их генов показал, что только восемь могут эффективно регулировать трансляцию mRNA. Это miR-558 (BIRC6), miR-1228* (LRP1), miR-1250 (AATK), miR-1469 (NR2F2), miR-2467-3p (HDAC4), miR-3182 (CDH13), miR-3196 (BIRC7), miR-4297 (EBF3), где в скобках указаны кодирующие их гены. Отметим, что miR-1469 действует на 2 сайта, а miR-1228* на 4 сайта mRNA кодирующих их генов. Из приведенных выше восьми miRNA, miR-558, miR-1228*, miR-1469 и miR- 3182 вместе с miR-1250 действуют на mRNA гена AATK. Этот пример показывает, насколько взаимосвязано с помощью in-miRNA может происходить экспрессия генов.
Полученные в настоящей работе данные свидетельствуют о важной регуляторной роли интронных miRNA в большом спектре биологических процессов, хотя исследование проведено только с 51 геном.
Увеличение числа генов являющихся мишенями для miRNA позволит получить новые свойства и закономерности регуляции экспрессии генов человека с помощью miRNA.
Литература
1 Vella M.C., Slack F.C. C. elegans microRNAs // The C. elegans Research Community. - 2005. - V. 6. - № 2. - P. 11-20.
2 Rodriguez A., et al. Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units // Genome Res.
- 2004. - V. 14. - P. 1902-1910.
3 Lutter D., Marr C., Krumsiek J., Lang E.W., Theis F.J. Intronic microRNAs support their host genes by mediating synergistic and antagonistic regulatory effects // BMC Genomics. - 2010. - V. 11:224. - doi:10.1186/1471- 2164-11-224.
4 Ying S.-Y., Lin S.-L. Current Perspectives In Intronic microRNAs (miRNAs) // Journal of Biomedical Science. - 2006. - V.13, № 2. - С. 23-30.
5 Lee E. J., Gusev Y., Jiang J. Expression profiling identifies microRNA signature in pancreatic cancer. // Int J Cancer. - 2006. - V. 45, № 3. - P. 36-40.
6 Bloomston M., Frankel W.L., Petrocca F. Profils d’expression du microARN pour différencier l’adénocarcinome pancréatique d’un pancréas normal et d’une pancréatite chronique // JAMA. - 2007. - V. 297. - № 17. - P. 190.
7 Iorio M.V., Ferracin M., Liu C.G. MicroRNA gene expression deregulation in // Cancer Res. - 2005. - V. 65. - P. 7065-7070.
8 Ryan B.M., Robles A.I., Harris C.C. Genetic variation in microRNA networks: the implications for cancer research // Nat. Rev. Cancer. - 2010. - V. 10 (6). - P. 389-402.
9 Emma V. B., et al. microRNA evaluation of unknown primary lesions in the head and neck // Molecular Cancer. - 2009. - V. 8. - № 127. - P. 1-7.
41
10 Gregersen L.H., Jacobsen A.B., Frankel L.B. et al. MicroRNA-145 Targets YES and STAT1 in Colon Cancer Cells // PLoS One. - 2010. - V. 5 (1). - e8836
11 Moore K.J., Rayner K.J., Suárez Y., Fernández-Hernando C. The Role of MicroRNAs in Cholesterol Efflux and Hepatic Lipid Metabolism // Annu. Rev. Nutr. - 2010. - aug,18. - e21548778.
12 Ogier-Denis, E., Vandewalle, A., Laburthe, M. MicroARN et physiopathologie intestinale // Medicine science. - 2007. - V. 23. - № 1. - P. 1-6.
13 Roldo C., Missiaglia E., Hagan J. P. MicroRNA expression abnormalities in pancreatic endocrine and acinar tumors are associated with distinctive pathologic features and clinical behavior // J. Clin. Oncol. - 2006. - V. 24.
- № 29. - P. 4677-4684.
14 Gee H.E., Buffa F.M., Camps C., Ramachandran A. et al. The small-nucleolar RNAs commonly used for microRNA normalisation correlate with tumour pathology and prognosis // Br. J. Cancer. - 2011. - V. 104 (7). - P.
1168-1177.
15 Dumas C. Cancer: découverte d’un nouveau responsable de la métastase // Bulletin du Cancer. - 2005. - V.
92. - № 9. - P. 757-762.
16 Bandyopadhyay S., Mitra R., Maulik U., Zhang M. Development of the human cancer microRNA network //
Silenc. - 2010. - 1. - P. 6.
Тұжырым
Бұл жұмыста 686 интронды miRNA-дың интронды miRNA кодтайтын 51 геннің mRNA-мен байланысу сайттары анықталды. Зерттелген miRNA-дың əрбір геннің mRNA-ның 5'UTR, CDS жəне 3'UTR-мен байланысу ерекшеліктері зерттелді. RNA функциональді бөліктерінің miRNA-мен байланыстыру сайттарының саны бойынша жəне бұл сайттардың орналасу тығыздығына байланысты гетерогенділік анықталды. Кейбір miRNA гендердің mRNA-на сұрыптаушылықпен ерекшеленеді.
Summary
Sites of interaction 686 intronic miRNAs with mRNAs of 51 genes coding intronic miRNAs are established.
Peculiarities of interaction of observed miRNAs with mRNAs of each gene in 5'UTR, CDS and 3'UTR are revealed.
Appreciable heterogeneity of functional sites of mRNAs on number of sites of linkage miRNAs with mRNAs and on density of locating of these sites is established. Intronic miRNAs differenst by selectivity to mRNAs of certains genes are revealed.
УДК 577.21
Исабекова А.С., Берилло О.А., Хайленко В.А., Атамбаева Ш.А., Иващенко А.Т.
СВОЙСТВА МЕЖГЕННЫХ miRNA ЧЕЛОВЕКА И ОСОБЕННОСТИ ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С mRNA
(Казахский национальный университет им. аль-Фараби)
Установлены сайты взаимодействия 784 межгенных miRNA с mRNA 52 генов кодирующих интронные miRNA. Выявлены особенности взаимодействия изученных miRNA с 5'UTR, CDS и 3'UTR mRNA каждого гена.
Обнаружение miRNA одно из важных открытий XXI века, которое существенно дополняет представления о регуляции процесса трансляции. miRNA – это малые некодирующие белок последовательности РНК длиной 16-27 нуклеотидов [1]. Эндогенная miRNA кодируется в геномах вирусов [2], бактерий [3], одноклеточных эукариот [4], беспозвоночных [5], высших растительных [6] и животных организмов [7]. miRNA регулируют экспрессию генов на пост-транскрипционном этапе блокируя инициацию или элонгацию трансляции. При высокой комплементарности mRNA гена с miRNA, mRNA подвергается деградации в процессирующих тельцах (п-тельцах) [8].
Большой интерес к miRNA проявляется потому, что нарушение профиля экспрессии miRNA связывают с различными системными заболеваниями, такими как рак [9,10], сердечно-сосудистые [11] и аутоиммунные заболевания [12]. Перспективы дальнейших исследований в этой области связаны с разработкой диагностических методов, развитием новых подходов лечения этих заболеваний на основе miRNA, предсказыванием и прогнозированием эффективности терапии.
Сайты взаимодействия miRNA с mRNA гена расположены на всех участках гена: 3’-нетранслируемом участке (3’UTR), 5'-нетранслируемом участке (5'UTR), белок-кодирующей нуклеотидной последовательности (CDS). Но большинство исследований посвящено изучению взаимодействии miRNA c 3’UTR mRNA [13] и существующие базы данных составлены в основном только по сайтам в 3’UTR mRNA. Однако, опубликованы данные исследований демонстрирующие эффективное взаимодействие miRNA с mRNA в 5'UTR и CDS [14, 15].
Многие miRNA кодируются в межгенных участках ДНК, поэтому эти miRNA называют межгенные miRNA (ig-miRNA). Интронные miRNA (in-miRNA) кодируются в интронах белок-кодирующих генов и транскрибируются с DNA автономно от транскрипции pre-mRNA при наличии собственного промотора, либо вырезаются из pre-mRNA в виде pre-miRNA.
42
При транскрипции межгенных miRNA образуются первичные транскрипты, которые обозначается как pri-miRNA. В последовательности pri-miRNA могут содержаться несколько pre-miRNA. В большинстве случаев десятки miRNA кодируются в одном кластере и вырезаются из одной pri-miRNA. Вырезание pre-miRNA из последовательности pri-miRNA происходит в ядре. Далее в цитоплазме осуществляется созревание miRNA путем вырезания из pre-miRNA двунитевой нуклеотидной последовательности со смещенными на 2 нуклеотида 5'- и 3'-концами. В большинстве случаев одна из этих нитей после образования комплекса с RISC (RNA-induced silencing complex) становится активной и связывается с mRNA-мишенью. Но в некоторых случаях работают обе молекулы, так как комплементарность этих зрелых miRNA не полная. В зависимости от степени комплементарности miRNA c mRNA при связывании комплекса RISC с mRNA и некоторых других свойств образовавшийся ассоциат приводит либо к блокированию синтеза белка, либо к разрезанию mRNA [16].
В настоящей работе изучены свойства miRNA человека и особенности их взаимодействия с mRNA в 5'UTR, CDS и 3'UTR. В качестве мишеней для ig-miRNA выбраны mRNA генов кодирующих in-miRNA. Эти гены представляют интерес, во-первых, как мишени для всех типов miRNA, и, во-вторых, как онкогены и онко- супрессорные гены рака желудочно-кишечного тракта. Подавляющее число работ по изучению miRNA проводилось с целью выявления взаимодействия отдельных miRNA с конкретными mRNA, а также их взаимосвязанной экспрессии. Представляется важным установить особенности и закономерности взаимодействия между 784 межгенными miRNA и 52 mRNA генов кодирующих miRNA.
Материалы и методы
В качестве материала использованы нуклеотидные последовательности mRNA генов, содержащих в интронах miRNA, заимствованы из GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) build 37.2. Нуклеотидные последовательности miRNA и их prе-miRNA получены из базы данных miRBase (http://www.mirbase.org).
Для поиска интронных miRNA была разработана программа miRNA Finder 2.2 (http://sites.google.com/site/malaheenee/software/mirna-finder). Для расчета величины свободной энергии гибридизации (ΔG) использовали программу RNAHybrid 2.1 (http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/).
Поиск сайтов связывания miRNA проводили по всей нуклеотидной последовательности mRNA. Отбирались сайты с наибольшей величиной свободной энергии относительно значения ΔG взаимодействия miRNA с полностью комплементарным участком mRNA. Сайты взаимодействия miRNA с mRNA определяли на основании величины ΔG и ее стандартного отклонения для каждого сайта с уровнем достоверности p<0,002.
Результаты и их обсуждение
С помощью разработанной программы для каждого гена были установлены межгенные miRNA, которые взаимодействуют с mRNA соответствующего гена (таблицы 1-5). Все гены распределили по группам в зависимости от особенностей взаимодействия их mRNA с ig-miRNA. Средняя плотность сайтов связывания ig-