В последние годы наблюдается заметное распространение особо опасных инфекционных болезней, ко- торые наносят большой экономический ущерб животноводству. Важнейшим и перспективным методом борьбы с инфекционными болезнями является иммунопрофилактика. Используемые в настоящее время вакцины для профилактики бруцеллёза требуют своего принципиального изменения и совершенство- вания. Одно из перспективных направлений при разработке безопасных и эффективных средств про- филактики — использование протективных антигенных белков Brucella spp. Целью данных исследова- ний являлось получение рекомбинантного белка IalB Brucella spp. методом бактериальной экспрессии в Escherichia coli. В результате проведенных исследований ген, который кодирует инвазивный белок IalB, был амплифицирован с геномной ДНК Brucella suis и клонирован в бактериальный экспрессиру- ющий вектор pET28b (+). Отработаны оптимальные условия экспрессии целевого гена в клетках E. coli, штамм ER2566 и условия очистки рекомбинантного белка — методом металл-аффинной хроматогра- фии. Степень очистки белка составила не менее 95 %. При иммунизации рекомбинантным белком IalB в организме мышей вырабатываются антитела, которые детектируются в иммуноферментном анализе.
Полученный рекомбинантный белок будет использован для разработки профилактических препаратов против бруцеллеза животных.
Ключевые слова: рекомбинантный белок, клонирование, экспрессия, бруцеллез, антитела.
Введение
Бруцеллез является бактериальной болезнью, наносящей большой экономический ущерб живот- новодству. Объединенный комитет экспертов ФАО информирует о повсеместном распространении бруцеллеза сельскохозяйственных животных [1, 2]. В Казахстане бруцеллез регистрируется практиче- ски у всех видов сельскохозяйственных и домашних животных (крупный рогатый скот, овцы, козы, свиньи, северные олени, маралы, лошади, верблюды, яки, буйволы, зебу, собаки). Эпизоотологически и экономически наиболее значимым является бруцеллез крупного рогатого скота [3–6].
Важнейшим и перспективным методом борьбы с инфекционными болезнями является иммуно- профилактика. Против бруцеллеза в разное время было предложено значительное количество инакти- вированных и живых вакцин. Наибольшее признание во всем мире получила живая вакцина против бруцеллеза из аттенуированного агглютиногенного штамма B. abortus 19, которая широко применялась в СССР, США и многих других странах мира. Существенным недостатком этих вакцин является нали- чие в крови иммунизированных животных антител, выявляемых в серологических реакциях, принятых для диагностики бруцеллеза, затрудняющих определение эпизоотического статуса животных по бру- целлезу [7, 8].
Таким образом, задача создания эффективной и безопасной вакцины против бруцеллеза остается актуальной. В связи с этим постоянно проводятся исследования по конструированию новых и совер- шенствованию протективных свойств имеющихся вакцин, как для людей, так и для животных. Пер- спективным направлением разработки эффективных вакцин против инфекционных заболеваний явля- ется создание аттенуированных рекомбинантных векторов, осуществляющих доставку в организм про- тективных антигенов, с которыми связано формирование профилактического или лечебного эффекта вакцинации [9].
На сегодняшний день было выявлено свыше 10 защитных белков Brucella. Как известно, инва- зивный белок IalB (BMEI 1584) также является протективным антигеном Brucella, который локализо- ван в цитоплазматической мембране. Данный белок идентичен с основным фактором вирулентности Bartonella bacilliformis, который играет основную роль в инфицировании эритроцитов человека [10, 11].
Целью данных исследований являлось получение рекомбинантного белка IalB Brucella spp. мето- дом бактериальной экспрессии в E. coli.
А.У. Исабек, Э.Т. Тайлакова и др.
Материалы и методы
Конструирование экспрессирующего вектора и создание штамма-продуцента E. coli. Нуклеотид- ную последовательность, кодирующую рекомбинантный белок IalB, амплифицировали с геномной ДНК B. suis, штамм 1330 — с использованием праймеров (FP-tctagatctagcctccctgcccgg, RP-acggtcgacct- tggtcaatgcctg) и клонировали в экспрессирующий вектор pET28b(+) (Novagen) по сайтам BamHI — SalI.
Корректность полученной конструкции подтверждали секвенированием. Затем вектор pET28/Bru-IalB трансформировали в компетентные клетки E. coli штамм ER2566 (NEB).
Экспрессия и очистка рекомбинантного белка. Клетки E. coli, штамм ER2566, трансформирован- ные вектором pET28/Bru-IalB, выращивали в среде LB-кан50 (содержание канамицина 50 мкг/мл) при 37 ºС на шейкере (250 об/мин) до OD600 = 0,6–0,8, затем добавлением ИПТГ до конечной концентра- ции 1 мМ индуцировали экспрессию целевого гена. Индуцированную культуру инкубировали в тече- ние 4 ч при тех же условиях. Затем клетки собирали центрифугированием и хранили при –70 ºС до использования. Растворимость рекомбинантного белка определяли с использованием реагента B-PER® Bacterial Protein Extraction Reagent (Thermo Scientific, США) согласно инструкции производи- теля. Для очистки рекомбинантного белка осадок клеток ресуспендировали в буфере (100 мМ Трис НСl pH 8,0, 150 мМ NaCl, 1 % тритон Х-100, 1 % ДОХ) из расчета 15 мл на 1 г сырого клеточного осадка. К полученной суспензии добавляли лизоцим до конечной концентрации 1 мг/мл. Лизис клеток осуществляли путем двукратного замораживания (–70 ºС) — оттаивания (+37 ºС) суспензии. Фракцию растворимых белков получали центрифугированием лизата клеток при 10000× g в течение 20 мин.
Очистку белка проводили методом металл-аффинной хроматографии с использованием HisPur™
Cobalt Superflow Agarose (Thermo Scientific, США) в нативных условиях согласно протоколу произво- дителя. Электрофоретический анализ полипептидов проводили в 12 % ДСН-ПААГ в денатурирующих редуцирующих условиях по Laemmli [12]. Для визуализации белков использовали окрашивание Coo- massie G-250. По интенсивности окрашивания белковых полос определяли чистоту целевого белка.
Иммунизация мышей. B исследовании использовали беспородных белых мышей (самки, 6–8 недель, масса 18–20 г). Очищенный белок соединяли с адъювантом Montanide Gel 01 (SEPPIC) в соот- ношении 9:1 (об./об.). Конечная концентрация белка составила 180 мкг/мл. Иммунизацию проводили подкожно трехкратно в дозе 25 мкг белка. Забор крови проводили из хвостовой вены. Сыворотки те- стировали в ИФА на наличие антител. Период наблюдения — 36 дней.
Иммуноферментный анализ. Для постановки ИФА 96-луночные планшеты (TPP, Швейцария) сенсибилизировали рекомбинантным белком IalB. С этой целью в каждую лунку планшета вносили по 100 мкл карбонат-бикарбонатного буфера, содержащего 2 мкг/мл рекомбинантного белка IalB. План- шеты инкубировали в течение ночи при 4 ºС. Затем планшеты трехкратно отмывали буфером TBST (150 мМ NaCl, 20 мМ трис-HCl, pH 7,5, 0,1 % твин-20) и блокировали, внося в каждую лунку по 100 мкл блокирующего буфера (150 мМ NaCl, 20 мМ трис-HCl, pH 7,5, 5 % обезжиренное сухое молоко). Дву- кратные разведения исследуемых сывороток вносили по 100 мкл в лунки планшета, инкубировали в течение 1 ч при 37 ºС. После трехкратной отмывки в лунки планшета вносили конъюгаты антимыши- ных IgG с щелочной фосфатазой (Sigma, США) в разведении 1:5000 и инкубировали в течение 1 ч при 37 ºС. Планшеты отмывали трехкратно и вносили по 100 мкл субстрата для щелочной фосфатазы (pNPP) (Sigma, США), инкубировали 30 мин. Оптическую плотность (ОП) измеряли с использованием микропланшетного ридера ImmunoChem-2100 при длине волны 405/630 нм. Титром считали наиболь- шее разведение сыворотки, в которой оптическая плотность специфической сыворотки в два и более раз превышала таковую нормальной сыворотки.
Результаты исследований
Амплификацию нуклеиновой последовательности гена IalB проводили методом ПЦР в объеме 50 мкл: 5 мкл 10× буфера, 1 мкл 10 мМ смеси дНТФ, по 1 мкл прямого и обратного праймеров, 2,5 ед.
Taq-полимеразы, 1 мкг ДНК, воды до 50 мкл. Температурный режим: 94 ºС — 2 мин; 30 циклов 94 ºС — 30 с, 50 ºС — 1 мин, 68 ºС — 1 мин; 68 ºС — 7 мин.
В результате ПЦР получили продукт размером приблизительно 490 п.о. (рис. 1). Расчетный раз- мер гена IalB составляет 489 п.о.
Экспрессия и очистка белка IalB Brucella spp.
М — маркер размера фрагментов ДНК; 1 — ПЦР-продукт (ген IalB) Рисунок 1. Электрофоретический анализ продуктов амплификации гена IalB
Амплифицированный фрагмент ДНК клонировали в плазмидный экспрессирующий вектор pET28b(+). Полученная рекомбинантная плазмида включала нуклеотидную последовательность белка IalB под контролем промотора Т7. На N- и С-концах аминокислотная последовательность имеет гисти- диновые таги His6 (рис. 2).
pBR322 origin — сайт начала репликации; kan r — ген устойчивости к канамицину;
lacI — ген репрессора лактозного оперона; T7 promoter — промотор фага;
Т7, T7 terminator — терминатор транскрипции фага;
Т7, IalB — встроенный рекомбинантный ген;
IalB, His6 — последовательность, кодирующая гексагистидиновый таг Рисунок 2. Карта плазмиды pET28/Bru-IalB
Полученная в результате клонирования плазмида была трансформирована в клетки E. coli штамм ER2566. Индукция экспрессии целевого гена ИПТГ приводила к наработке белкового продукта разме- ром около 21 кДа, что соответствовало расчетной величине молекулярного веса рекомбинантного белка (рис. 3).
pET28/Bru-IalB
5806 bp
lacI IalB His6
His6
kan r T7 promoter
pBR322 origin
T7 terminator
А.У. Исабек, Э.Т. Тайлакова и др.
М — маркер молекулярного веса белков; 1 — лизат клеток до индукции экспрессии;
2 — лизат клеток после индукции экспрессии, рекомбнантный белок IalB обозначен звездочкой Рисунок 3. Электрофоретический анализ полипептидов клеточных лизатов E. coli
С целью выбора условий очистки рекомбинантного белка IalB определили его растворимость при экспрессии в клетках E. coli. Как видно из рисунка 4, целевой белок накапливается в клетке в раство- римой форме.
М — маркер молекулярного веса белков; 2 — растворимая фракция белков;
3 — нерастворимая фракция белков (включения) Рисунок 4. Определение растворимости целевого белка
Металл-аффинная хроматография является высокоспецифичным и надежным методом очистки рекомбинантных белков вследствие относительно высокого сродства и специфичности некоторых ме- таллов к эпитопу, содержащему шесть или более остатков гистидина [13]. При создании генетической конструкции для экспрессии целевого гена в состав нуклеотидной последовательности были включены участки, кодирующие гексагистидиновые таги (рис. 2). Это позволило использовать для очистки целе- вого белка метод металл-аффинной хроматографии. Очистку белка проводили в нативных условиях.
Из рисунка 5 (дорожки 8, 9) видно, что использованный метод очистки позволил получить препа- раты рекомбинантного белка с чистотой не менее 95 %.
Экспрессия и очистка белка IalB Brucella spp.
М — маркер молекулярного веса белков; 1 — клеточный лизат; 2 — клеточный лизат после фильтрации;
3 — проскок через колонку; 4–6 — промывки; 7–8 — элюирование белка
Рисунок 5. Электрофоретический анализ белковых фракций в процессе очистки целевого белка IalB Также нами была проведена оценка способности рекомбинантного белка IalB стимулировать гу- моральный иммунный ответ. Для этого мыши были иммунизированы препаратом рекомбинантного белка с адъювантом. Наличие антител к целевому белку определяли в динамике начиная с 20-х суток после первой иммунизации.
NS — нормальная сыворотка; SS — специфическая сыворотка; DPI 20 — 20 сутки после иммунизации;
DPI 27 — 27 сутки после иммунизации; DPI 34 — 34 сутки после иммунизации Рисунок 6. Результаты иммуноферментного анализа
В результате было установлено, что рекомбинантный белок IalB вызывает в организме животных выработку специфических антител. Максимальный титр антител в сыворотке крови животных в ИФА отмечен на 20-е сутки с начала иммунизации и составил 1:64 000.
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
1 NS, DPI 20
NS, DPI 27 NS, DPI 34 SS, DPI 20 SS, DPI 27 SS, DPI 34
Титр разведений сывороток
Показателиоптической плотности
А.У. Исабек, Э.Т. Тайлакова и др.
Выводы
В результате проведенных исследований была создана генетическая конструкция для экспрессии белка IalB в клетках E. coli. Отработаны оптимальные условия экспрессии и очистки целевого реком- бинантного белка. Степень очистки белка составила не менее 95 %. При иммунизации рекомбинант- ным белком IalB в организме мышей вырабатываются антитела, детектируемые в иммуноферментном анализе. Полученные рекомбинантный белок IalB и специфическая сыворотка к нему будут использо- ваны при разработке профилактических препаратов против бруцеллеза животных.
Список литературы
1 Иванов Н.П. Инфекционные болезни животных / Н.П. Иванов, К.А. Тургенбаев // Общая эпизоотология. — 2013. —
№ 1. — С. 47.
2 Иванов Н.П. Бруцеллез животных и меры борьбы с ним: учеб. пос. / Н.П. Иванов. — Алматы: Атамұра, 2007. — 610 с.
3 Ашетов И.К. Мониторинг и анализ эпизоотической ситуации по бруцеллезу КРС в РК за 2007–2012 годы / И.К. Аш- метов, А.Е. Ешмухаметов, И.Н. Ашетов. — Алматы, 2012. — С. 79–86.
4 Ибрагимов П.Ш. Мониторинг эпизоотической ситуации по особо опасным болезням животных в Республике Казах- стан, анализ и ожидаемый прогноз заболеваний за 2007–2012 годы: учеб.пос. / П.Ш. Ибрагимов. — Астана, 2013. — 74 с.
5 Еспембетов Б.А. Анализ эпизоотической ситуации по бруцеллезу животных в Казахстане за 2013 год / Б.А. Еспембе- тов, Н.С. Сырым, Н.Н. Зинина // Вестн. Алтайского гос. ун-та. — 2017. — № 11. — С. 25–29.
6 Еспембетов Б.А. Мониторинг и анализ эпизоотической ситуации бруцеллеза животных в Казахстане за 2011–2015 гг.
/ Б.А. Еспембетов, Н.С. Сырым, Н.Н. Зинина // Вестн. Ульянов. гос. с.-хоз. акад. — 2017. — № 1. — С. 92–96.
7 Аракелян П.К. Оптимизация мероприятий при бруцеллезе сельскохозяйственных животных в современных условиях / П.К. Аракелян, С.К. Димов // Ветеринария. — 2013. — № 4. — С. 23–27.
8 Саяпина Л.В. Современное состояние вакцинопрофилактики особо опасных инфекций / Л.В. Саяпина, В.П. Бондарев, Ю.В Олефир // Проблемы особо опасных инфекций. — 2016. — № 2. — С. 107–110.
9 de Figueiredo P. Pathogenesis and immunobiology of brucellosis: review of Brucella-host interactions / P. de Figueiredo, T.A. Ficht, A. Rice-Ficht, C.A. Rossetti, L.G. Adams // American Society for Investigative Pathology. — 2015. — No. 185(6). — Р. 1505–1517.
10 Crasta O.R. Genome sequence of Brucella abortus vaccine strain S19 compared to virulent strains yields candidate virulence genes / O.R. Crasta, O. Folkerts, Z. Fei, S.P. Mane, C. Evans, S. Martino-Catt, B. Bricker, G. Yu, L. Du, B.W. Sobral // PLoS ONE.
— 2008. — Vol. 3(5). — P. 21–93.
11 Commander N.J. The identification of two protective DNA vaccines from a panel of five plasmid constructs encoding Brucella melitensis 16M genes / N.J. Commander, S.A. Spencer, B.W. Wren, A.P. MacMillan // Vaccine. — 2007. — Р. 43–54.
12 Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K. Laemmli // Nature.
— 1970. — Vol. 227. — P. 680–685.
13 Hochuli E. Genetic approach to facilitate purification of recombinant proteins with a novel metal chelate adsor-bent / E. Hochuli, W. Bannwarth, H. Dobeli, R. Gentz, D. Stu-ber // Biotechnology. — 1988. — Vol. 6. — P. 1321–1325.
А.У. Исабек, Э.Т. Тайлакова, Г.О. Шыныбекова, В.М. Строчков, О.В. Червякова
Brucella spp. IalB ақуызының экспрессиясы және тазалау әдісі
Соңғы жылдары мал шаруашылығына үлкен зиян келтіретін аса қауіпті жұқпалы аурулардың елеулі таралуы байқалады. Жұқпалы аурулармен күресудің ең маңызды және перспективті тәсілі — иммунды түрде алдын алу. Бруцеллез ауруын алдын алу үшін қазіргі уақытта қолданылатын вакциналар түбе- гейлі өзгеруді және жақсартуды талап етеді. Қауіпсіз және тиімді алдын алу құралдарды дамытудағы болашақта қажет бағыттардың бірі — Brucella spp. антигенді ақуыздарды қолдану. Жұмыстың мақ- саты — Escherichia coli негізінде бактериалы экспрессия әдісін пайдалана отырып, Brucella spp. IalB рекомбинантты ақуызын алу болып табылады. Зерттеулер нәтижесінде инвазивті IalB ақуызын кодтай- тын ген Brucella suis геномдық ДНҚ-мен амплифицирленіп, кейін бактериялық экспрессияланатын pET28b (+) векторына клондалды. Рекомбинантты ақуызды металл-аффинді хроматография әдісімен тазартудың және E. coli жасушасының ER2566 штаммында тұтас генді экспрессиялаудың тиімді жағ- дайы таңдалып алынды. Ақуызды тазарту дәрежесі кем дегенде 95 % құрады. IalB рекомбинантты ақу- ызбен иммундау кезінде зертханалық тышқандардың ағзасында иммуноферментті талдауда анықтала- тын антиденелер пайда болатыны көрсетілді. Алынған рекомбинантты ақуыз малдардың бруцеллезіне қарсы профилактикалық препараттарды әзірлеу үшін қолданылатын болады.
Кілт сөздер: рекомбинантты ақуыз, клондау, экспрессия, бруцеллез, антиденелер.
Экспрессия и очистка белка IalB Brucella spp.
A.U. Isabek, E.T. Taіlakova, G.O. Shynybekova, V.M. Strochkov, O.V. Chervyakova
Expression and purification of protein IalB Brucella spp.
In recent years, there has been a noticeable spread of highly dangerous infectious diseases that cause great economic damage to livestock. The most important and promising method of combating infectious diseases is immunoprophylaxis. Currently used vaccines for the prevention of brucellosis require their fundamental changes and improvements. One of the promising areas in the development of safe and effective means of prevention is the use of protective antigenic proteins Brucella spp. The purpose of this research was to obtain recombinant protein IalB Brucella spp. by bacterial expression in Escherichia coli. As a result of the research, the gene encoding the invasive IalB protein is amplified from Brucella suis genomic DNA and cloned into the bacterial expression vector pET28b (+). The optimal conditions for the expression of the target gene in E. coli cells, strain ER2566 and purification of the recombinant protein by metal affinity chromatography were devel- oped. The degree of protein purification was at least 95 %. When immunization with recombinant protein IalB in the body of mice antibodies is produced that is detected in the enzyme immunoassay. The resulting recom- binant protein will be used to develop prophylactic drugs against animal brucellosis.
Keywords: recombinant protein; cloning; expression, brucellosis, antibodies.
References
1 Ivanov, N.P. (2013). Infektsionnye bolezni zhivotnykh [Infectious animal diseases]. Obshchaia epizootolohiia — General epizootology, 1, 47 [in Russian].
2 Ivanov, N.P. (2007). Brutsellez zhivotnykh i mery borby s nim [Animal brucellosis and control measures]. Almaty: Atamura [in Russian].
3 Ashetov, I.K. (2012). Monitorinh i analiz epizooticheskoi situatsii po brutsellezu KRS v RK za 2007–2012 hody [Monitoring and analysis of the epizootic situation for cattle brucellosis in Kazakhstan for 2007–2012]. Almaty [in Russian].
4 Ibragimov, P.Sh. (2013). Monitorinh epizooticheskoi situatsii po osobo opasnym bolezniam zhivotnykh v Respublike Kazakh- stan, analiz i ozhidaemyi prohnoz zabolevanii za 2007–2012 hody [Monitoring of the epizootic situation of especially dangerous animal diseases in the Republic of Kazakhstan, analysis and expected disease prognosis for 2007–2012]. Astana [in Russian].
5 Espembetov, B.A. (2017). Analiz epizooticheskoi situatsii po brutsellezu zhivotnykh v Kazakhstane za 2013 hod [Analysis of the epizootic situation on animal brucellosis in Kazakhstan for 2013]. Vestnik Altaiskoho hosudarstvennoho universiteta — Bulletin of the Altai State University, 11, 25–29 [in Russian].
6 Espembetov, B.A. (2017). Monitorinh i analiz epizooticheskoi situatsii brutselleza zhivotnykh v Kazakhstane za 2011–2015 hh.
[Monitoring and analysis of the epizootic situation of animal brucellosis in Kazakhstan for 2011–2015]. Vestnik Ulianovskoi hosudar- stvennoi selskokhoziaistvennoi akademii — Bulletin of the Ulyanovsk State Agricultural Academy, 1, 92–96 [in Russian].
7 Arakelian, P.K. (2013). Optimizatsiia meropriiatii pri brutselleze selskokhoziaistvennykh zhivotnykh v sovremennykh uslovi- iakh [Optimization of measures for brucellosis of farm animals in modern conditions]. Veterinariia — Veterinary science, 4, 23–27 [in Russian].
8 Saiapina, L.V. (2016). Sovremennoe sostoianie vaktsinoprofilaktiki osobo opasnykh infektsii [The current state of vaccination of especially dangerous infections]. Problemy osobo opasnykh infektsii — Problems of especially dangerous infections, 2, 107–110 [in Russian].
9 de Figueiredo, P., Ficht, T.A., Rice-Ficht, A., Rossetti, C.A., & Adams, L.G. (2015). Pathogenesis and immunobiology of brucellosis: review of Brucella-host interactions. American Society for Investigative Pathology, 185, 6, 1505–1517.
10 Crasta, O.R., Folkerts, O., Fei, Z., Mane, S.P., Evans, C., Martino-Catt, S., Bricker, B., Yu, G., Du L., & Sobral, B.W. (2008).
Genome sequence of Brucella abortus vaccine strain S19 compared to virulent strains yields candidate virulence genes. PLoS ONE, 3, 5, 21–93.
11 Commander, N.J., Spencer, S.A., Wren, B.W., & MacMillan, A.P. (2007). The identification of two protective DNA vaccines from a panel of five plasmid constructs encoding Brucella melitensis 16M genes. Vaccine, 43–54.
12 Laemmli, U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage 4. Nature, 227, 680–
685.
13 Hochuli, E., Bannwarth, W., Dobeli, H., Gentz, R., Stuber, D. (1988). Vol. 6. Genetic approach to facilitate purification of recombinant proteins with a novel metal chelate adsor-bent. Biotechnology, 6, 1321–1325.
UDC 579.577.637.1
S.M. Barmak1, 2, Yu.A. Sinyavskiy2, A.B. Berdygaliev2, I.S. Savitskaya1, T.Sh. Sharmanov1, I.Н. Mendenhall3, E.V. Zholdybaeva4
1Al-Farabi Kazakh National University, Almaty, Kazakhstan;
2Kazakh Academy of Nutrition, Almaty, Kazakhstan;
3Duke-NUS Medical School, Singapore;
4NationalCenter for Biotechnology, Nur-Sultan, Kazakhstan (E-mail: [email protected])