• Ешқандай Нәтиже Табылған Жоқ

Раздел 2

БИОТЕХНОЛОГИЯ

© 2021 Al-Farabi Kazakh National University ISSN 1563-0218; eISSN 2617-7498 Experimental Biology. №2 (87). 2021 https://bb.kaznu.kz

80

МРНТИ 34.27.19, 34.27.39,65.63.35, 62.09.39 https://doi.org/10.26577/eb.2021.v87.i2.08 М.К. Иманбаева1* , Р.А. Арынова2 , Ж.К. Масалимов1 ,

А.Ю. Просеков3 , Г. Серикбай2

1Евразийский национальный университет имени Л.Н. Гумилева, Казахстан, г. Нур-Султан

2Астанинский филиал ТОО «Казахский научно-исследовательский

институт перерабатывающей и пищевой промышленности», Казахстан, г. Нур-Султан

3Кемеровский государственный университет, Россия, г. Кемерово

*e-mail: imanbaeva_madina@inbox.ru

СОЗДАНИЕ ПРОБИОТИЧЕСКОГО БИОПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ЛАКТОЗОУТИЛИЗИРУЮЩИХ

МИКРООРГАНИЗМОВ

На сегодняшний день 60% населения Казахстана страдают гиполактазией. Кроме этого, производство безлактозных кисломолочных продуктов на рынке Казахстана наблюдается в незначительном количестве. В связи с этим, цель настоящего научного исследования заключается в разработке закваски как пробиотического биопрепарата, созданной на основе молочнокислых бактерий, выделенных из казахский традиционных продуктов питания. Практическая значимость исследования заключается в возможности производить безлактозные кисломолочные продукты в промышленных условиях, на основе разработанной технологии. В качестве закваски использовались штаммы Lactobacillus acidophilus, Enterococcus faecium. Проведенные нами ранее исследования показали, что лактобактерии обладают лактозоутилизирующими свойствами.

Генетическую идентификацию бактерий проводили на основе гена 16S rRNA, применяли периодическое культивирование при различных диапазонах NaCl, pH. Эксперименты по динамики роста изучали в зависимости от времени культивирования. Исследования показали, что Lactobacillus acidophilus, Enterococcus faecium развиваются в кислой среде pH˂7. Селективной средой для размножения и развития являются благоприятными, где концентрация соляной кислоты составляет около 5%. Применимости полученных результатов исследований актуальна для микробиологической, биотехнологической и молочной промышленности. Практическое значение итогов проведенной работы заключается в импортозамещении дорогостоящих пробиотических препаратов. Разработанный пробиотик по ценовому предложению дешевле зарубежных аналогов, так как создана на основе микроорганизмов, выделенных на территории Республики Казахстан.

Ключевые слова: периодическое культивирование, лактобактерии, безлактозная закваска.

M.K. Imanbayeva1, R.A. Arynova2, Zh.K. Masalimov1, A.Yu. Prosecov3, G. Serikbay2

1L.N. Gumilyov Eurasian National University, Kazakhstan, Nur-Sultan

2Astana branch Limited Liability Partnership Kazakh research institute of processing and food industry, Kazakhstan, Nur-Sultan

3Kemerovo state university, Russia, Kemerovo

* e-mail: imanbaeva_madina@inbox.ru 

Creation of a probiotic biological product based on lactose-utilizing microorganisms

Today 60% of the population of Kazakhstan suffers from hypolactasia. In addition, the produc- tion of lactose-free fermented milk products in the Kazakhstan market is observed in an insignificant amount. In this regard, the purpose of this scientific research is to develop a starter culture as a pro- biotic preparation based on lactic acid bacteria isolated from Kazakh traditional food products. The practical significance of the research lies in the ability to produce lactose-free fermented milk products in an industrial environment, based on the developed technology. Strains of Lactobacillus acidophilus, Enterococcus faecium were used as a starter culture. Our earlier studies have shown that lactobacilli have lactose-utilizing properties. Genetic identification of bacteria was carried out on the basis of the 16S rRNA gene; batch cultivation was used at different ranges of NaCl, pH. Experiments on the dy- namics of growth were studied depending on the time of cultivation. Studies have shown that Lactoba- cillus acidophilus, Enterococcus faecium develop in an acidic pH˂7 environment. Selective breeding and development media are favorable, where the concentration of hydrochloric acid is about 5%. The

81 М.К. Иманбаева и др.

applicability of the research results obtained is relevant for the microbiological, biotechnological and dairy industries. The practical significance of the results of this work lies in the import substitution of expensive probiotic preparations. The developed probiotic is cheaper than foreign counterparts at the price offer, since it is created on the basis of microorganisms isolated in the territory of the Republic of Kazakhstan.

Key words: batch culture, lactobacilli, lactose-free starter culture.

М.К. Иманбаева1, Р.А. Арынова2, Ж.К. Масалимов1, А.Ю. Просеков3, Г. Серикбай2

1Л.Н. Гумилев атындағы Еуразия ұлттық университеті, Қазақстан, Нұр-Сұлтан қ.

2Астана филиалы ЖШС «Қазақ қайта өңдеу және тағам өнеркәсіптері ғылыми-зерттеу институты», Қазақстан, Нұр-Сұлтан қ.

3Кемерово мемлекеттік университеті, Ресей, Кемерово қ.

*e-mail: imanbaeva_madina@inbox.ru

Лактозаны жоятын микроорганизмдер негізінде пробиотикалық биопрепаратын өнімді құру

Бүгінгі күні Қазақстан халқының 60% гиполактазиямен ауырады. Сонымен қатар, Қазақстан нарығында лактозасыз ашытылған сүт өнімдерінің өндірісі шамалы мөлшерде байқалады. Осыған орай, осы ғылыми зерттеудің мақсаты – қазақтың дәстүрлі тағам өнімдерінен оқшауланған сүт қышқылды бактерияларға негізделген пробиотикалық препарат ретінде стартерлік дақылдарды дамыту. Зерттеудің практикалық маңыздылығы дамыған технологияға негізделген өндірістік жағдайда лактозасыз ашыған сүт өнімдерін шығару мүмкіндігінде. Стартер дақылы ретінде Lactobacillus acidophilus, Enterococcus faecium штамдары қолданылды. Біздің алдыңғы зерттеулеріміз лактобактериялардың лактозаны қолданатын қасиеттері бар екенін көрсетті. 16S rRNA генінің негізінде бактериялардың генетикалық идентификациясы жүргізілді; NaCl, pH әр түрлі диапазонында топтамалық өсіру қолданылды. Өсу уақытына байланысты өсу динамикасы бойынша тәжірибелер зерттелді. Зерттеулер Lactobacillus acidophilus, Enterococcus faecium pH˂7 қышқыл ортада дамитынын көрсетті. Селективті өсіру және дамыту орталары қолайлы, мұнда тұз қышқылының концентрациясы шамамен 5% құрайды. Алынған зерттеу нәтижелерінің қолданылуы микробиологиялық, биотехнологиялық және сүт өнеркәсібі үшін маңызды. Осы жұмыс нәтижелерінің практикалық маңыздылығы қымбат пробиотикалық препараттарды импортпен алмастыруда. Әзірленген пробиотик шетелдік аналогтарға қарағанда баға бойынша арзан, өйткені ол Қазақстан Республикасының аумағында оқшауланған микроорганизмдер негізінде жасалады.

Түйін сөздер: мерзімді өсіру, лактобактериялар, лактозасыз ашытқы.

Введение

Гиполактазия – характеризуется нарушени- ем абсорбции молочного сахара лактозы, после приема лактозосодержащих молочных продук- тов [1]. Когортное исследования по рациону пи- тания выявили взаимосвязь расстройства желу- дочно-кишечного тракта и низкой активностью расщепления молочного сахара (лактозы). Сим- птомами, которого являются боль в животе, диа- рея, потеря веса [2].

Как известно молоко и молочные продук- ты являются источниками Ca, K, различных групп витаминов таких как: D, B. Люди стра- дающие гиполактазией, сталкиваются с дефи- цитом данных микро и макроэлементов [3].

Группой ученых был проведен мета-анализ, где изучали сыворотку крови людей страда- ющих гиполактазией. Было установлено, что низкий показатель витамина D связано со сни-

женной минеральной плотности костной тка- ни [4]. Также была обнаружена, положитель- ная корреляция с болезнью пищеварительной системы и частотой переломов [5,6,7]. В связи с тем, что воспалительные заболевания кишеч- ника и снижение плотности костей связаны с гиполактозией. Ученые предлагают использо- вать пробиотики на основе консорциумов лак- тобактерий с целью уменьшения симптомов непереносимости лактозы [8].

Ряд исследований показал, что определен- ные штаммы молочнокислых бактерий, воз- можно использовать в пробиотических целях в качестве пищевых добавок, у пациентов с не- переносимостью лактозы. Так как микроорга- низмы проявляли специфическую активность к β-галактозидазе [9]. Пробиотики определяются как живые микроорганизмы, полезные для здо- ровья при употреблении в пищу с высоким ко- личеством жизнеспособных клеток. Лактобак-

82

Создание пробиотического биопрепарата на основе лактозоутилизирующих микроорганизмов

терии наиболее часто используются в качестве пробиотиков [10,11]. Многие ученые из различ- ных стран выделяют новые молочнокислые бак- терии с функциональными свойствами из есте- ственных источников, такие как традиционные молочнокислые ферментированные продукты питания. Выбор в качестве пробиотического микроорганизма основывается на нескольких исследований: устойчивости к желчным солям, устойчивости к низкому или высокому pH, под- вергаются адгезии, моделирование условий же- лудочно-кишечного тракта и способности иметь высокую жизнеспособность [12].

В своих исследованиях ряд ученых обнару- жили определенные штаммы молочнокислых бактерий, ферментирующих лактозу, таких как Faecaibacterium, Bifdobacterium и Lactobacillus [13].

На сегодняшний день, все больше исследо- ваний направлено на создание функциональных продуктов питания для людей страдающих ги- полактазией. Так группа ученых разработали безлактозный функциональный йогурт, фермен- тированный пробиотическими культурами [14].

Другая группа ученых применяли метод хромо- генного культивирования. В процессе совмест- ного культивирования различных ассоциаций молочнокислых бактерий. На основе подсче- та жизнеспособных штаммов лактобактерий в ферментированном молоке селективно выбран- ных на основе дифференциальной активности b-галактозидазы и b-глюкозидазы [15].

Польза ферментированных продуктов за- ключается в изменении микробиоты желудочно- кишечного тракта, что оказывает положитель- ное влияние по предотвращению остеопороза и других заболеваний ассоциированных с гипо- лактазией [16 ].

Благодаря современным методам иссле- дования, сегодня доступные диагностические методы основанные на нескольких подходах, включая тест на лактозное дыхание (LBT), тест на толерантность к лактозе (LTT), генетический тест и оценку активности лактазы в образцах би- опсии тощей кишки [17].

Согласно статистическим данным, самый высокий показатель встречаемости данного за- болевания зафиксировано в странах Юго-Вос- точной Азии от 15% до 100%, Северной Амери- ке 79%, Латинская Америка 51%, Европейские страны от 5% до 50% [18].

На сегодняшний день встречаемость гипо- лактазии в Казахстане составляет 60 %. В свя-

зи с этим разработка безлактозной закваски на основе штаммов выделенных из традиционных казахских молочных продуктов питания являет- ся актуальной. Полученные результаты иссле- дований могут применяться в таких отраслях как: микробиологическая, биотехнологическая и молочная промышленность. Разрабатывае- мая технология имеет социальный и экономи- ческий эффект. Основной рынок безлактозных молочных продуктов экспортируется из стран ближнего и дальнего зарубежья. Таким обра- зом, итогов проведенной работы заключается в импортозамещении дорогостоящих пробиоти- ческих препаратов. Разработанный пробиотик по ценовому предложению дешевле зарубеж- ных аналогов.

Материалы и Методы

Выделение и изучение культурально-морфо- логических свойств молочнокислых бактерий

Для получения чистых культур из жидких и полужидких гомогенных продуктов (кумыс, айран и сметана) был использован метод деся- тичных разведений с последующим пересевом на твердую питательную среду (MRS, HiMe- dia), которая является селективной по отноше- нию к молочнокислым бактериям [19]. Твер- дые продукты питания (творог, масло, курт) растирали ступкой до однородной кашеобраз- ной массы, после чего также получали разве- дения и производили посев газоном на чашки.

Чашки помещали в термостат на 2-е суток при 37 °С. Отбор и определение принадлежности выделенных изолятов к МКБ проводили окра- ской по Грамму, подвижности, и микроскопии мазков [20].

Генетическая идентификация бактериаль- ных культур на основе гена 16S rRNA

Выделение ДНК проводили методом, опи- санным Kate Wilson, который позволяет эффек- тивно выделять ДНК из грамотрицательных и грамположительных культур.

Амплификация фрагмента 16S rRNA гена для бактерий. Реакция ПЦР была выполне- на с универсальными праймерами [21] 8f 5’

– AgAgTTTgATCCTggCTCAg-3 и 806R- 5’

ggACTACCAgggTATCTAAT в общем объ- еме 30 мкл. ПЦР смесь содержала 25 нг ДНК, 1 Ед. Maxima Hot Start Taq DNA Polymerase (Fermentas), 0,2 mM каждого дНТФ, 1-х ПЦР буфер (Fermentas), 2,5 mM MgCl2, 10 пмоль каждого праймера. Программа ПЦР амплифи-

83 М.К. Иманбаева и др.

кации включала длительную денатурацию 95

°С в течение 3 минут; 32 цикла: 95 °С – 30 се- кунд, 55 °С- 40 секунд, 72 °С – 60 секунд; за- ключительная элонгация 10 минут при 72 °С.

ПЦР программа была выполнена с применени- ем амплификатора GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems).

Определение нуклеотидной последователь- ности. Очистку ПЦР продуктов от несвязавших- ся праймеров проводили ферментативным мето- дом, используя Exonuclease I (Fermentas) и ще- лочную фосфатазу (Shrimp Alkaline Phosphatase, Fermentas) [22 ].

Реакцию секвенирования проводили с применением BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applide Biosystems) согласно инструкции производителя, с последующим разделением фрагментов на автоматическом ге- нетическом анализаторе 3730xl DNA Analyzer (Applide Biosystems).

Полученную нуклеотидную последователь- ность сопоставляли с нуклеотидными последо- вательностями международных баз данных.

Определение оптимального диапазона кис- лотности, концентрации NaCl при температу- ре 37 Со при периодическом культивировании

Биомассу культур микроорганизмов куль- тивируют в жидкой питательной среде MRS при t 25 Со на шейкере в течение 72, 120, 168 часов. Затем готовят 9 пробирок с автоклави- рованной стерильной дистиллированной водой объемом 9 мл. Для посева на плотные питатель- ные среды производиться из разведений 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000, 1:100000, 1:10000 и т.д [23]. Свежеприготовленную агарированную пи- тательную среду охлаждают до 48–50 Со. Далее ровным слоем распределяя по поверхности сте- рильной чашки Петри толщиной 3–5 мм. Сте- рильной пипеткой вносят 12 мл исследуемой культуры из соответствующего разведения, предварительно перемешанного. Распределе- ние микроорганизмов осуществляется стериль- ным шпателем. При посеве из разных разведе- ний применяют новую стерильную пипетку.

Необходимо осуществлять 2 – параллельных высева. Чашки Петри помещают в термостат, чашками вниз, устанавливая оптимальную тем- пературу для культивирования исследуемых микроорганизмов [24].

Далее 100 мл свежеприготовленной жидкой питательной среды MRS бульон стерилизован-

ной при t 120 Со под давлением 1А в автоклаве

«Стерилизатор паровой ВК- 75-01» в течение часа. Затем в стерилизованные питательные сре- ды в ламинар боксе «LAMSYSTEM» добавляли NaOH (гидроксид натрия) для увеличения диа- пазона рН, HNO3 (азотную кислоту) для умень- шения диапазона рН. Диапазон рН жидкой пи- тательной среды анализировали на рН-метром Mettler Toledo SevanCompact. Культивирование осуществляюсь при температуре 25 Со, в колбах объемом 250 мл на шейкере в течение 3 суток (72 часа), 5 суток (120 часов), 7 суток (168 ча- сов). Эксперимент осуществлялся в трех повтор- ностях [19].

Затем в стерилизованные жидкие питатель- ные среды MRS бульон в ламинар боксе «LAM- SYSTEM» добавляли 2 гр. NaCL, 5 гр. NaCL, 7 гр. NaCL. Далее добавлял маточную культуру лактобактерий Lactobacillus acidophilus в кон- центрации 5% от общего объема питательной среды. Культивирование осуществляюсь при температуре 25 Со, в колбах объемом 250 мл на шейкере в течение 3 суток (72 часа), 5 суток (120 часов), 7 суток (168 часов). Для обработки полу- ченных статистических данных использовали:

Чашечный метод количественного учета микро- организмов. Метод Коха.

Общую микробную обсемененность рассчи- тывают по количеству выросших колоний т.е.

количество КОЕ в 1 мл определяли по формуле:

(1) где, а – количество выросших колоний; 10n – разведение; V – посевная доза (0,1мл) [25].

Результаты и Обсуждения

Выделение и изучение культурально-морфо- логических свойств молочнокислых бактерий

Коллекция чистых молочнокислых бакте- рий была выделена из казахских традиционных кисломолочных продуктов питания таких как:

айран, кумыс, шубат, иримшик, курт, домашнее масло. Согласно таблице 1 штаммы отбирались согласно следующим признакам, характерным для молочнокислых бактерий: однородные ко- лонии белого или беловато-молочного цвета с ровными краями и выпуклой поверхностью.

Изолированные отдельоно стоящие культуры, возможно, было получить на 3 или 4ом пересеве.

84

Создание пробиотического биопрепарата на основе лактозоутилизирующих микроорганизмов

Таблица 1 ‒ Накопление чистой культуры микроорганизмов выделенных из продуктов домашнего приготовления

Посев Результаты пересева

Микроорганизмы выделенные из кумыса

Форма круглая с гладким краем, поверхность матовая, профиль плоский.

Средние колонии диаметром 4 мм, имеют белый цвет. Однородная структура.

Имеет мягкую слизистую консистенцию.

Микроорганизмы выделенные из айрана

Форма круглая с волнистым краем поверхность матовая, изогнутый профиль.

Однородная структура,имеющая мягкую консистенции. Колонии средние диаметром 3 мм, имеет белый цвет.

Микроорганизмы выделенные из шубата

Форма круглая с гладким краем, поверхность матовая, профиль плоский.

Средние колонии диаметром 4 мм, имеют белый цвет. Однородная структура.

Имеет мягкую слизистую консистенцию.

Микроорганизмы выделенные из иримшик

Форма округлая с неправельнымаи краеми, профиль плоский поверхность ко- лонии блестящее, средние колонии диаметром 3 мм, имеет серо-белого цвета.

Однородная струкутура. Имеет мягкую слизистую консистенцию.

Микроорганизмы выделенные из домашнего молока

Форма круглая, края волокнистые, профиль плоский, колонии блестящие, мелкие точечные диаметром 1 мм. Однородная струкутура. Имеет хрупкую консистенцию, рассыпающиеся при прикосновении петлей.

Микроорганизмы выделенные из айрана

Форма круглая с валиком по краю, края и поверхность гладкие, профиль изо- гнутый, матовый, белого цвета. Диаметром 4 мм.

85 М.К. Иманбаева и др.

Посев Результаты пересева

Микроорганизмы выделенные из курта

Овальной или круглой формы, поверхность гладкая, профиль плоский, бле- стящая, белого цвета. Диаметром 3 мм.

Форма круглая,поверхность гладка, профиль плоский, блестящий, белого цве- та. Диаметром 6 мм.

Микроорганизмы выделенные из иримшик

Круглая форма, Форма круглая, края волокнистые, профиль плоский, колонии блестящие, средние колонии диаметром 3 мм, белого цвета. Однородная стру- кутура. Имеет мягкую слизистую консистенцию.

Форма круглая с гладким краем, поверхность блестящая, профиль плоский.

Средние колонии диаметром 2 мм, имеют белый цвет. Однородная структура.

Имеет мягкую слизистую консистенцию.

Микроорганизмы выделенные из масло (домашнее)

Форма круглая с валиком по краям, края волнистые, поверхность шерохова- тая, матовая, белого цвета.Диаметром 5 мм

Продолжение таблицы 1

86

Создание пробиотического биопрепарата на основе лактозоутилизирующих микроорганизмов

Генетическая идентификация бактериаль- ных культур на основе гена 16S rRNA

В результате генетической идентификации с помощью нуклеотидной последовательности на основе гена 16S rRNA, было установлено, что 13 полученных штаммов молочнокислых бактерий относятся к Enterococcus и Lactobacillus. Резуль- таты генетической идентификации представле- ны в таблице 2.

Определение оптимального диапазона кис- лотности, концентрации NaCl при температу- ре 37 Со при периодическом культивировании

В качестве объектов, входящих в состав за- кваски для производства безлактозных кисломо- лочных продуктов были использованы штаммы Lactobacillus acidophilus, Enterococcus faecium.

В процессе периодического культивирования

определены оптимальные диапазоны кислот- ности (рН), солености среды и температурного режима объектов исследования.

Обращая внимание на мутность жидкой пи- тательной среды можно визуально диагностиро- вать положительный процесс культивирования Lactobacillus acidophilus, Enterococcus faecium на 3-ие сутки (72 часа), 5ые сутки (120 часов), 7-ые сутки (168 часов). Таким образом, в колбах, где про- водили культивирование в жидких питательных средах MRS, отмечается помутнение и пена. Что свидетельствует о положительной динамике роста Lactobacillus acidophilus, Enterococcus faecium.

На 72 сутки были взяты микроорганизмы из разведений под пробирками № 6,7,8. При посад- ке на 120 сутки из пробирок № 5,6,7, затем на 168 сутки из пробирок № 4,5,6 (рисунок 1).

Таблица 2 – Результаты генетической идентификации

Условные обозначения Наименование Субстрат выделения % идентичности

Р 1 Enterococcus thailandicus шубат 99,84

Р 2 Enterococcus lactis кумыс 100

Р 3 Enterococcus durans иримшик 99,68

Р 4 Enterococcus faecium айран 99,54

Р 5 Lactobacillus zeae домашнее масло 100

Р 6 Lactobacillus paracasei кумыс 100

Р 7 Lactobacillus rhamnosus курт 99,48

Р 8 Lactobacillus fermentum шубат 99,65

Р 9 Lactobacillus gorillae айран 100

Р 10 L. reuteri шубат 99,59

Р 11 L. johnsonii иримшик 100

Р 12 L. helveticus курт 99,74

Р 13 L. curvatus айран 99,81

Рисунок 1 ‒ Приготовления разведения для периодического культивирования

Согласно описанному процессу, проведен- ные исследования дали возможность установить высокий, низкий титр клеток в различных усло- виях среды (диапазона кислотности, солености и температурного режима).

Определено, что на 72 часу развития штаммы Lactobacillus acidophilus, Enterococcus faecium показали незначительное число образовавшихся колоний. Данное явление связано с адаптацией вносимых бактерий в питательные среды с за-

87 М.К. Иманбаева и др.

данными условиями и вхождением микроорга- низмов в лаг-фазу своего роста.

Обратив внимание на количественный по- казатель КОЕ\мг возможно сделать заключе- ние что, Lactobacillus acidophilus, Enterococcus faecium имеют максимальное значение на 5ые сутки (120 часов). Биомасса бактерий с низким титром клеток выявлена на 168 сутки.

В процессе периодического культивирова- ния определены оптимальные диапазоны кис- лотности (рН), концентрация соляной кислоты и выход биомассы при культивировании темпера- турном режиме соответствующему 37 Со.

Полученные данные будут необходимы для получения жидкой и сухой формы закваски для производства безлактозных кисломолочных про- дуктов. На основе, живых культур Lactobacillus acidophilus, Enterococcus faecium.

Как известно, основным показателем для естественного роста бактерий является реакция среды. В результате изменения кислотности в критическую сторону наблюдается снижение показателей жизнедеятельности штаммов ми- кроорганизмов. Несмотря на другие оптималь- ные условия окружающей среды.

В нашем исследовании, был изучен про- цесс динамики роста Lactobacillus acidophilus и

Enterococcus faecium в MRS питательной среде, имеющий различный диапазон кислотности рН 5, 6,4, 8,5.

Согласно рисунку 2 максимальная динами- ка роста Lactobacillus acidophilus наблюдается на 5-ые сутки (120 часов), КОЕ/мг 7,8х108, где, установлен оптимальный уровень кислотности среды (рН), который имеет показатель 5. В диа- пазоне рН 6,4 – 8,5 по сравнению с рН 5 имеют меньшую степень роста.

Таким образом, было определено, что кис- лые среды благоприятно влияют на рост Lacto- bacillus acidophilus, чем нейтральные и щелоч- ные питательные среды.

Наиболее благоприятный уровень кислот- ности для энтерококков Enterococcus faecium яв- ляется рН 6,4. Где, также наблюдается логариф- мический рост. При этом на 3ие сутки (72 часа) зафиксированных КОЕ/мг 5,5 х109, максималь- ное число КОЕ/мг 5,8 х108 обнаружено также на 120 сутки. На 7ые сутки КОЕ/мг 3,8х107, что свидетельствует о снижение показателей жиз- недеятельности микроорганизма, приводящий к уменьшению динамики роста Enterococcus fae- cium. Полученные данные свидетельствуют о том, что для Enterococcus faecium развивается в кислой среде (рН <7).

Рисунок 2 ‒ Оптимальные диапазоны кислотности (рН)

Выживаемость и динамика роста пробиоти- ческих микроорганизмов в кислых условиях сре- ды являются ключевым фактором. Исследова- ния по культивированию Lactobacillus acidophi- lus, Enterococcus faecium в селективной среде с концентрацией NaCL 2%, 5%, 7%.

Штаммы благоприятно развиваются в пита- тельной среде имеющий коэффициент солености

в 5% (рисунок 3). На 120 сутки культивирова- ния объектов исследования, может характеризо- ваться как экспоненциальная фаза роста. Так как Lactobacillus acidophilus имеет 6,7х108 КОЕ\мг, Enterococcus faecium 4х108КОЕ\мг. Культивируе- мые микроорганизмы по мере приближения к ста- ционарной фазе (168 часов) показывает снижение роста по сравнению с 120 часами культивирова-

88

Создание пробиотического биопрепарата на основе лактозоутилизирующих микроорганизмов

ния. Lactobacillus acidophilus от 6,7 КОЕ\мг (120 ч) до 4,3 КОЕ\мг (168 ч), Enterococcus faecium от 4 х108КОЕ\мг (120 ч) до 2,5х107КОЕ\мг (168 ч).

Полученные данные периодического куль- тивирования при установленном температурном режиме соответствующему 37Со.

Рисунок 3 ‒ Оптимальные диапазоны концентрация соляной кислоты (NaCL)

Известно, что главным фактором для культи- вирования микроорганизмов важную роль игра- ет температурный режим. Нормальная темпера- тура желудочно-кишечного тракта составляет 37 Со. Культивирование Lactobacillus acidophilus, Enterococcus faecium при температуре 37 Со осу- ществлялось также в течение 72, 120 и 168 часов.

Было установлено, что логарифмическое увеличение численности культуры зафиксиро- вано до стационарной фазы роста на 5-ые сутки при периодическом культивировании. Числен- ность Lactobacillus acidophilus с 5,5х109 КОЕ/мг (72 часа) увеличивалось до 6,8х108 КОЕ/мг (120 часа), Enterococcus faecium имеет аналогичную тенденцию к максимальному росту колоний от 72 часов 1,9х109 КОЕ/мг до 120 часов 2,5х108 КОЕ/мг. К 168 часам (7 сутки) указывают на снижение колониеобразующих единиц.

Заключение, выводы

В рамках реализации проекта «Технология производства безлактозных кисломолочных продуктов» в лаборатории «Микробиология и биотехнология» проведены исследования по из- учению динами роста с целью создания проби- отического биопрепарата на основе лактозоути- лизирующих микроорганизмов.

В результате на основании проведенных нами исследований была создана коллекция из 13 штаммов молочнокислых бактерий выде- ленных из казахских домашних традиционных

кисломолочных продуктов. Определена генети- ческая идентификация лактобактерий и изучены культурально-морфологические свойства.

Установлен оптимальный показатель кислот- ности среды (рН) для Lactobacillus acidophilus, Enterococcus faecium является кислая среда.

Lactobacillus acidophilus – рН 5, Enterococcus faecium – рН 6,4.

Наиболее благоприятной средой для под- держания жизнедеятельности микроорганизмов Lactobacillus acidophilus, Enterococcus faecium является среда, имеющая концентрацию соля- ной кислоты около 5%.

На выращенной питательной среде MRS- агара с концентрацией соляной кислоты (NaCL) – 2% и 7 % рассматриваемые изоляты бактерий Lactobacillus acidophilus, Enterococcus faecium, показали плохой рост на 3ий, 5ый и 7ый сутки.

Перечисленные исследования способствова- ли определению оптимумов, различных диапа- зонов кислотности, солености, при которых вы- являются максимальный рост и выход биомассы Lactobacillus acidophilus, Enterococcus faecium.

На основе полученных данных были уста- новлены параметры культивирования на фер- ментере для получения безлактозной закваски в жидкой форме. Проведенные исследования спо- собствуют разработки безлактозной закваски в порошкообразном и жидком виде.

На данном этапе ведутся работы по внедре- нию и применении полученной безлактозной за- кваски в производство.