Новые образования с признаками других видов (в пределах тетраплоидных пшениц) отмечены почти во всех комбинациях скрещивания. Так, абиссинские твердые пшеницы, характеризующиеся мягким построением колоса (T.durum subsp.abyssinicumVav) появилось в следующих комбинациях: T.turgidum.var.herrorae × T.turanicum var.notaibil; T.persicum var.fuliginosum × T.turgidum (43174); T.persicum (K-27656) × T.turanicum (K- 39319); T.durum Харьковская 46 × T.turanicum (K-43671); абиссинский T. turgidum subsp. abyssinicum vav. в скрещиваниях - T.turgidum (43174) × T.durum subsp. abyssinicum (К 19289), T.turgidum (43174) х T.turanicum (К- 39319), обычные твердые пшеницы (T.durum Desf.) в скрещиваниях - T.persicum (38526) × T.durum subsp.
abyssinicum (К-19289), T.polonicum (21441) × T.turgidum (43174). В скрещиваниях T.turgidum (43174) c T.persicum (K 38526), T.persicum (K 38526) c T.durum Харьковская 46, T.persicum (K 7887) c T.turanicum (K 39319), T.polonicum (21441) T.durum subsp abyssinicum (К 19289) среди сегрeгатов появились растения с признаками T.dicoccum и переходных форм: T.duro - dicoccum, turanico - dicoccum, tugrido - dicoccum, T.dicocco – aethiopicum.
Из выше приведенных данных можно видеть, что виды культурных тетраплоидных пшениц создавались путем рекомбинации наследственных факторов, что способствовало проявлению множества новых признаков и разновидностей, и подвидов в различных рекомбинантах. Возникновение все эти многообразие форм культурных видов, подвидов пшеницы в природе обусловлено, по всей вероятности свободная рекомбинация ряда количественных признаков, экологической изоляцией, различиями характеризующими наследственно закрепленными комплексом морфофизиологических признаков. По этой причине один и тот же линнеевский вид встречается независимо в разных регионах земного шара. Так, например T.рolonicum и T.turanicum не имеют определенного ареала и встречаются в виде примесей, главным образом в посевах durum, turgidum одновременно в Африке, Сирии, Палестине, Германии, Эфиопии, Средней Азии [4,5]. Е.Ф. Пальмова [9]
отмечала закономерность в географическом распределении морфологических признаков колоса (окраска, плотность и форма колоса, длина остей, зубцы колосовых чешуй) и считала, что эти признаки не только систематическими, но и экологическими.
Таким образом, отсутствие четких морфофизиологических особенностей и генетического барьера, полная геномная совместимость, гомологии формообразовательного процесса позволят нам объединить все культурные виды тетраплоидных пшениц в одни группы «голозерные» пшениц, родоначальникими, которых являлись виды T.dicoccum и T.dicoccoides. При этом особое поведение T. timopheevii Zhuk. при скрещивании с тетраплоидными видами, можно объяснить ее структурной дифференциацией хромосом в процессе эволюции [2,3].
68
Одним из видообразующей системы в процессе эволюции пшеницы является мутация, реконструкция ломкости колоскового стержня и цветковых чещуй, переход от спонтанного и полуспонтанного типа колоса на легко обмолачиваемые формы. В этой связи спонтанная ломкость колоса T.dicoccoides, полуломкости T.dicoccum в группе тетраплоидных пшениц расценена как полигенная (видообразющая) система связанное с экологической дифференциацией культурных «голозерных» видов пшеницы.
На основании литературных данных и результатов собственных исследовании мы пришли к выводу, что культурная полба dicoccum произошла от дикой двузернянки, вследствие генетических перестроек в процессе окультуривания. В дальнейшем под влиянием географической дивергенции, возможно экологической изоляции и нарастающей культуры земледелия, из полбы дифференцировались современные культурные пшеницы (subsp: durum, turgidum, aethiopicum, polonicum, turanicum , и др.).
В течение длительно естественной эволюции, которая произошла с пшеницей эммер, она широко распространилась под влиянием человека по территории земного шара на высоких горах. Под её влиянием дифференцировались различные морфо-экологические типы. В основе расхождения по морфологическим особенностям экологических групп лежит дивергенция генетических структур популяции. В этом отношении высота над уровнем моря, по-видимому, является основным фактором (лаборатория) в выделении в формировании экологических типов (durum, turgidum, aethiopicum, polonicum и др.). Для 28 хромосомных культурных пшениц естественный отбор в различных эколого-географических зон дифференцировались, различные экологические группы, ныне условно названные подвидами. Среди них виды T.рolonicum и T.turanicum практически не достигли уровня культурных видовых популяций. Они обычно встречаются как примеси в посевах T.durum и T.turgidum.
На основании литературных данных и результатов собственных исследовании мы пришли к убеждению, что для практического использования для селекционеров наиболее удобна система рода Triticum основы которые заложены А. Шульц [12]. Его филогенетический принцип получил дальнейшее развитие в трудах Н.И.Вавилова (1935) и К.А. Фляксбергера (1935). Н.И. Вавилов (1964) все разнообразие виды и подвиды пшеницы дифференцировал на эколого-географической группы, в соответствии их по числу хромосом. Как селекционные, так и районированные местные и зарубежные сорта пшеницы распределены соответственно эколого-географическими группами. Селекционеры НИИЗиР предусматривается для Казахстана создание следующих агроэкотипов: Южно-казахстанские (горный, поливной, сухостепной), заподноказахстанские (сухостепной, поливной) и Восточноказахстанские (горные и сухостепной)[13]. Интерес эколого- географической классификации обусловливаются в значительной мере тем, что она связано с запросами практической селекции. Таким образом, на основании генетического исследовании видовых признаков пшеницы, гомологии формообразовательного процесса видов и подвидов, а также на основе эколого- географического принципа Н.И.Вавилова мы предлагаем общую схему взаимоотношении видов пшеницы можно представить следующим образом:
Таблица 4 - Cистема рода Triticum L. на основе генетико – экологических данных (по: [ Жангазиев А.С., 2010]
с изменениями) Sectio
(секция) Specios Subsp
(эколого - географические группы) 2n Геном
1 2 3 4 5
Diploidea (2n-14)
Т. Boeticum. Boiss.
T. urartu Тhum.
Дикорастущие:
subsp. aegilopoides Bal subsp. thaoudar Perciv subsp. urartu Vav.
возделываемые пленчатые:
subsp.. monococcum.L subsp. sinskajae Filatet Kurk
14 14 14 14 14
Ab Ab Au Ab Ab T.dicoccoides. korn.
T.araraticum Jakubz
дикорастущие:
subsp. armeniacum Vav.
subsp. horanicum Vav.
subsp. palestinicum Vav.
subsp. araraticum Jakubz
28 28 28 28
AuB AuB AuB AbG T.timopheevii Zhukob возделываемые плечатые:
subsp. timopheevii Zhukob subsp. armeniacum Jakubz subsp. georgicum. Dekapr
28 28 28
AbG AbG AuB Tetraploidea
(2n=28)
T.dicoccum Schubl Возделываемые культурные пшениц:
T.dicoccum s.l.subsp.asiaticumVav.
subsp.marococcum Vav.
subsp.georgicumVav.
28 28 28
AuB AuB AuB
69 Продолжение таблицы 4
1 2 3 4 5
subsp.abyssinicumVav.
T.durum s. l.subsp. durum Mac Key subsp. abyssinicumVav.
convar.turanicum(Jakubz)Vav. subsp.sinicum Vav.
subsp.persicum(Vav) Mac Key
subsp.turgidum(L) Mac Key convar. polonicum (L) Mac Key
28 28 28 28 28 28
AuB AuB AuB AuB AuB AuB возделываемые пленчатые:
subsp. zhukovsky(Men.et Er). Mac Key subsp. macha(Dekapr.et Men) Mac Key subsp. spelta Mac Key
42 42 42
AuBD AuBD AuBD Hexaploidea
(2n=42) T.spelta Nevski
возделываемые голозерные:
T.vulgare:subsp.irano-asiaticum Flaksb.
subsp.indicum Vav.
subsp.euasiaticumVav.
subsp. compactum(Host) Mac Key subsp.sphaerococcum(Percival)MacKey
42 42 42
AuBD AuBD AuBD
Генетика видовых признаков пшеницы проанализирована. Таксономические признаки положенные К.
Линнеем основаны на однозначных генах и контролируется простым генным (1-3 и полимерным) отношением.
Эти генные отношения не могут быть достаточным критерием для определения видового статуса. С точки зрение эволюции аллополиплоидии и ломкости колоса диких видов являются основными видообразующими системами. Этим путем возникла дикая тетраплоидная пшеница – Эммер. В этой связи, а также и в результате многолетних исследовании межвидовых гибридов пшеницы, предложено включить в род Triticum только семь видов: T.boeticum, T.urartu T.araraticum, T.dicoccoides, T.timopheevi T.dicoccum T.spelta. Все остальные виды относятся к естественным культурным эколого-географическим категориям - видов и подвидов пшеницы.
Литература
1 Bowden W.M. The taxonomy and nomenclature of the wheat, barley, and rye and their wild relatives // Canad.
J.Bot. 1959.Vol.37.P.657-684.
2 Моррис Р.,Сирис Э.Р. Цитогенетика пшеницы и родственных форм// Пшеница и ее улучшение.
М.:Колос, 1970.С. 33-110.
3 Мак Кей Дж. Генетические основы систематики пшениц // Селекция самоопыляющихся культур.М.,1969. – С.149-165.
4 Фляксбергер К.А. Пшеница – род Triticum L. // Культурная флора СССР. – 1935.Т.1. –С.153-156.
5 Жуковский П.М. Природа и объем вида у культурных растений.// Ботан. Жур. 1967. Т.52.№10.1530- 1539.
6 Дорофеев В.Ф., ФилатенкоА.А. и др. Культурная флора СССР. –Л.: Колос, 1979.- Т.1 -346 с.
7 Гончаров Н.П.Сравнительная генетика и их сородичей. Новосибирск,2002.252 с.
8 Вавилов Н.И. Закон гомологических рядков в наследствненной изменчивости, Изд.переработюи расш.М.; Л.; Селхозгиз, 1935а. 56 с.
9 Мак Кей Дж. Генетические основы систематики пшениц // Селекция самоопыляющихся культур.м.,1969. – С.149-165.
10 Пальмова Е.Ф. Введение в экологию пшениц.М.; Л.: Сельхозгиз,1935.75 с.
11 Уразалиев Р.А. Шегебаев О.Ш. Новый сорт получения гибридных семян зерновых культур // Весник с.- х.науки Казахстана, 1981.№4. С. 30-32.
12 Schulz A. Die geschichte der kultivierten Getreide. Nebert, Halte, 1913.-134
13 А.С. Уразалиев Р.А., Жангазиев А.С., Нурбеков С.И. Экологическая селекция сортов озимой пшеницы для предгорной и поливной зоны юга и юго-востока Казахстана и Центральной Азии // Агромеридиан. – 2008. –
№ 2 (8). – С. 33-41.
Тұжырым
Бидай түрлеріне морфологиалық «маркерліқ» белгілеріне генетиқалық талдау жасалынды. К. Лннеей жасап кеткен бидай түрлерінің морфологиялық белгілері ұрпақтан ұрпақтарга жəй гендер(бір - екі) арқылы беріліп отырады. Осы жəй гендер бидай түрлерінің мəртебесін анықтай алмайды. Эволюциялық даму процессің заңдылығына жүгінсек бидайдің жаңа түрлерінің пайда болу себебінің бірі аллоплоидия жəне жабаиы бидайдің масагының тікелей сынгыш қасиетінін, сынбайтын мəдени қасиетіне айлану жагдайына тікелей байланысты.
Осы аталган жолдар бойынша жабайы жəне мəдени тетраплойтты бидайдың жаңа түрлері пайда болды.
Бидайдің филогенезіне сұйене отырып жəне түр аралық будандарының түлға түзу нəтижесі бойынша бидай түрлері мəртебесіне ылайықтылар: T.boeticum, T.urartu T.araraticum, T.dicoccoides, T.timopheevi T.dicoccum T.spelta.. Ал,басқа бидай түрлері эколого географиялық түрлермен, түршелер топтарына жатады.
70 Summary
The genetics of specific traits of wheat is analysed. Taxonomic traits by K.Linneey are based on the minor genes and аre controlled by very simple gene (1-3 and polymeric) relation. These simple gene relations can't be sufficient criterion for definition of the specific status. From a point allopolyploidy evolution and alteration of fragility of an ear of wild species are the basic systems of formation of species. Wild tetraploid wheat – Emmer has arisen by this way.
So, together with a result of long-term researches of interspecific hybrids of wheat, it is offered to include in species of Triticum only seven species: T.boeticum, T.urartu T.araraticum, T.dicoccoides, T.timopheevi, T.dicoccum, T.spelta. All other species concern to natural cultural ecology-geographical categories - species and subspecies of wheat.
577.217.5:577.218:578.821.2
1Надирова Л.Т., 1Станбекова Г.Э., 2Червякова О.В., 2Сандыбаев Н.Т.,
2Султанкулова К.Т., 2Строчков В.М., 1Жигайлов А.В., 1Полимбетова Н.С.,
2Зайцев В.Л., 1Искаков Б.К.
СИНТЕЗ БЕЛКА ВНЕШНЕЙ ОБОЛОЧКИ ВИРУСА ОСПЫ ОВЕЦ В РАСТИТЕЛЬНОЙ СИСТЕМЕ in vitro
(1Институт молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина,
2Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности)
Клонирован кДНК-ген EEV119, кодирующий трансмембранный белок, локализующийся во внешней оболочке вируса оспы овец (SPPV) штамма «НИСХИ». Построены рекомбинантные конструкции «Y-EEV119- TMV» и «ARCх3-EEV119-ТМV». В качестве 5'-нетранслируемой последовательности (5'НТП) конструкция «Y- EEV119-TMV» содержала 5'НТП (Y) геномной (г)РНК Y-вируса картофеля (PVY), а конструкция «ARCх3- EEV119-ТМV» – три копии 10-нуклеотидной вставки (ARCх3), комплементарной центральному району 18S рРНК пшеницы (нуклеотиды 1113-1122). Были синтезированы in vitro соответствующие мРНК, которые транслировали в бесклеточной системе зародышей пшеницы. Показано, что обе конструкции обеспечивают значительный уровень синтеза белка EEV119 SPPV, при этом 5'НТП гРНК PVY обладала наибольшей способностью усиливать синтез белков.
Получение трансгенных растений – продуцентов вакцин является одним из перспективных направлений генетической инженерии. Исследования последних лет показали, что белки различных микроорганизмов можно успешно производить в растительных системах с сохранением их иммуногенных свойств. При переносе в геном растения чужеродные гены стабильно интегрируются и передаются потомкам. Установлено, что аппарат транскрипции и трансляции у растений является универсальным и может быть адаптирован не только для гомологичных белков, не синтезируемых данным видом растения, но и для синтеза гетерологичных белков бактериального и вирусного происхождения.
Культивирование растений не требует дорогостоящего оборудования, а сельскохозяйственные масштабы продукции гарантируют доступность рекомбинантного препарата в количествах, достаточных для клинических испытаний и широкого иммунопрофилактического использования. В отличие от животных, растительные клетки не содержат в своём составе патогенные для человека и животных вирусы, а также прионы и, таким образом, могут служить безопасным источником рекомбинантных белков лечебного назначения. Хотя стоимость выделения и очистки целевого белка из растений-продуцентов может быть сопоставима с таковой для других систем, наработка сырого материала обходится значительно (в сотни раз) дешевле. В ряде случаев, например, при использовании трансгенных растений в качестве "съедобных вакцин" выделение белка в чистом виде не требуется.
В настоящее время во многих лабораториях мира на основе трансгенных растений разрабатываются вакцины против различных болезней человека и животных [1-3], многие из которых проходят клинические испытания и готовы к практическому использованию [4-6]. В связи с этим особый интерес представляет получение вакцин на основе трансгенных растений против оспы овец.
Целью нашей работы является получение трансгенных растений для профилактики оспы овец (по классификации и номенклатуре вирусов, принятой в Мадриде в 1975 году, вирус оспы овец (SPPV) отнесён к роду Capripoxvirus, входящему в обширное семейство Poxviridae [7]). Для создания “съедобных вакцин” к данному вирусу нами был выбран вирусный белок оболочки EEV119. Прежде чем приступать к созданию трансгенных растений, трансформированных геном EEV119, необходимо было проверить, способна ли мРНК этого белка корректно транслироваться в растительных системах под контролем различных (вирусных и искусственных) трансляционных усилителей (энхансеров). В данной работе представлены результаты исследований по синтезу в растительной системе in vitro рекомбинантного белка оболочки вируса оспы овец EEV- 119.
71
Материалы и методы
В работе использовали вирус оспы овец, эпизоотический штамм "А" и вакцинный штамм "НИСХИ". Очистку и концентрирование вируса проводили по комбинированной схеме, отработанной в Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности (НИИПББ).
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) использовали для амплификации фрагмента гена белка оболочки EEV119 SPPV. Прямой (№1) и обратный (№2) праймеры, содержащие соответственно сайты рестрикции NcoI и XbaI, были синтезированы в НИИПББ на основе имеющейся нуклеотидной последовательности гена этого белка. Последовательности праймеров даны ниже (полужирным шрифтом указаны вносимые мутации, а курсивом –сайты рестриктаз):
праймер №1 (NcoI): 5'GAACTTTAAACCATGGTAGTTGATGT3' праймер №2 (XbaI): 5'TGTTTGTCTAGATAATGACTTC 3'.
В качестве матрицы использовалась гДНК SPPV. Реакционная смесь объемом 50 мкл имела следующий состав: 10 мМ Трис HCl (pH 8,3); 50 мМ KCl; 1,5 мМ МgСl2; 10 мМ ДТТ; по 200 мкМ каждого из dNTP; 2 мкг гДНК SPPV; 100 ед/мл ДНК-полимеразы Pwo (“Roche”) и по 2 мкл олигонуклеотидов №1 и №2.
Амплификацию ДНК проводили в следующем температурном режиме:
Стадия 1: 5 мин. 94 °C – 1 цикл.
Стадия 2: 30 сек. 94 °C, 1 мин. 43 °C, 45 сек 72 °C – 30 циклов.
Стадия 3: 5 мин. 72 °C – 1 цикл.
Конструирование плазмид. Рекомбинантные конструкции, содержащие ген EEV119 SPPV, получали с применением стандартных методов генетической инженерии. В качестве исходных ДНК-конструкций использовали полученные ранее конструкции «Y-GUS-TMV» и «(ARCx3)-GUS-TMV», из которых с помощью рестриктаз NcoI и XbaI выщепляли ген GUS, кодирующий β-глюкуронидазу, и лигировали по этим же сайтам рестрикции ДНК-фрагмент, соответствующий кодирующей области гена белка внешней оболочки SPPV EEV119.
Транскрипцию in vitro с использованием РНК-полимеразы фага Т7 проводили по модифицированной методике Гуревича [8]. Реакционная смесь объемом 50 мкл содержала 250 мМ Hepes-КОН (pH 7,5), 30 мМ Mg(Ac)2, 40 мМ ДТТ, 2 мМ спермина, по 7 мМ каждого из рибонуклеозидтрифосфатов, 2 ед/мкл ингибитора рибонуклеаз (RNAsine), 1 ед./мкл Т7 РНК-полимеразы и 0,4 мкг соответствующей ДНК-констркции, предварительно линеаризованной рестриктазой EcoRI.
Трансляция in vitro проводилась в бесклеточной системе синтеза белка из зародышей пшеницы сорта ''Казахстанская 4'', выделенной по методике, описанной ранее [9]. Реакционная смесь объемом 25 мкл имела следующий состав: 20 мМ Трис-Ас (рН 7,6), 90 мМ KАc, 2,0 мМ Mg(Ac)2, 1 мМ АТР, 0,1 мМ GTP, 10 мМ креатинфосфата, 0,12 мг/мл креатинфосфокиназаы, 0,1 мМ спермидина, по 0,1 мМ всех аминокислот кроме метионина, 0,1 мМ радиоактивного [35S] L-метионина (74000 Bq), 1 мкг РНК-конструкции и 11 мкл экстракта из зародышей пшеницы. Реакционную смесь инкубировали в течение одного часа при 26°С. Эффективность трансляции определяли по способности новосинтезированных полипептидов включать радиоактивный метионин посредством авторадиографии полиакриламидных гелей после электрофоретического анализа.
Электрофорез белков в 15% полиакриламидном геле проводили по стандартной методике [10]. После окончания электрофореза гели вымачивали в 10% глицерине и сушили на сушилке для гелей. Высушенные гели анализировали авторадиографией на рентгеновскую пленку.
Иммуноблоттинг использовали для детекции рекомбинантного белка в реакционных смесях после окончания реакции трансляции in vitro. По окончании электрофореза осуществляли электроперенос белков с геля на нитроцеллюлозные мембраны полусухим способом. Вестерн блотинг проводили по стандартной методике [11]. В качестве первых антител использовали сыворотки лабораторных животных (мышей или кроликов), иммунизированных очищенными препаратами SPPV штамма «НИСХИ» (вакцинный) и «А»
(эпизоотический). В качестве вторых антител использовали пероксидазные конъюгаты антивидовых антител.
Пероксидазную активность выявляли с помощью преципитирующего в результате реакции субстрата – 3,3'- диаминобензидина.
Результаты и их обсуждение
К настоящему времени известна полная нуклеотидная последовательность геномной ДНК вируса оспы овец [12]. Это обстоятельство позволяет проводить клонирование различных фрагментов вирусного генома возбудителя.
Учитывая экономическое значение вируса оспы овец, его потенциал для распространения в неэнзоотические регионы, а также необходимость создания против данного заболевания высокоэффективных и экономически выгодных вакцин, нами проведены исследования структуры генов вируса, кодирующих оболочечные белки, способные вызывать иммунный ответ в организме животных [13]. Отбор проводили в сравнительном анализе с имеющимися данными по антигенным белкам вирусовакцины штамма "Копенгаген".
Для проведения эксперимента нами была выбрана отрытая рамка считывания (ОРС) ЕЕV119 генома вируса оспы овец штамма "НИСХИ", кодирующая наружный оболочечный белок (поверхностный антиген).
Аналогом данного гена является ОРС A33R вирусвакцины штамма "Копенгаген", для которого ранее была показана антигенная активность. На рисунке 1 представлена последовательность участка кДНК исследуемого гена.
72
Рисунок 1 - Нуклеотидная последовательность участка кДНК, соответствующая кодирующей области